龙 芳，文 芳，聂 蕾，张其柱，吴章颖，訾 聃△，张家龙，李 谊

(1.贵州医科大学附属医院妇产科，贵阳 550004； 2．贵州省六盘水市妇幼保健院妇产科 553000；3.贵州省六盘水市人民医院病理科 553000；4.贵州省六盘水市妇幼保健院病理科 553000)

卵巢恶性肿瘤是我国女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，资料显示，卵巢肿瘤发病率越来越高，对妇女生命造成严重威胁。在全球范围内，每年有12.5万人死于卵巢肿瘤[1]，2010年我国因卵巢癌死亡的病例约1.76万例[2]。卵巢肿瘤形成过程中存在着包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡调控基因的失调等各类基因表达的异常情况发生，同时研究发现肿瘤易发生细胞侵袭转移的特性与趋化因子受体可促进肿瘤的生长、血管的生成及肿瘤的远处转移密切相关[3]。有足够的原始研究性文章可以证实趋化因子12(CXCL12)/CXCR4 在肿瘤细胞的凋亡过程中起到非常关键的作用。在众多凋亡控制基因中，B淋巴细胞瘤/白血病-2基因(Bcl-2)蛋白家族和半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)家族最受关注，目前国内外对于CXCR4与细胞凋亡相关因子(Bcl-2、Bax、caspase-3)联合研究较少，故本研究希望为卵巢癌的靶向治疗提供进一步的理论依据。

1 材料与方法

1.1组织及细胞来源 选择贵州医科大学附属医院、贵州省六盘水市妇幼保健院病理科及贵州省六盘水市人民医院病理科存档石蜡标本上皮性卵巢癌患者39例为恶性组，其中早期(FIGO Ⅰ、Ⅱ)卵巢癌26例，晚期(FIGO Ⅲ、Ⅳ)卵巢癌13例，浆液性癌35例，黏液性癌4例，年龄29～72岁，中位年龄49岁。选择同一时期40例卵巢良性上皮肿瘤患者手术切除标本作为良性对照组。卵巢癌细胞株OVCAR3购自昆明医科大学细胞库中心。

1.2主要试剂 DMEM高糖、胰酶消化液、磷酸盐缓冲液(PBS)、双抗(美国Hyclone)，胎牛血清(德国PAN Bitech公司)，CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3多克隆抗体(英国Abcam公司)，AMD3100(美国Thermo公司)。

1.3方法

1.3.1细胞培养 卵巢癌细胞株OVCAR3常规培养于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养液中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中进行培养，PBS冲洗2～3次，0.25%的胰酶常规消化传代。细胞分为3组：阴性对照组(PBS)、AMD3100 10 μg/mL组及AMD3100 100 μg/mL组。

1.3.2免疫组织化学法 收集的标本均经10%中性甲醛固定，常规切片行苏木素-伊红(HE)染色。免疫组织化学染色方法按试剂盒说明书进行，每批染色均用PBS代替一抗作阴性对照，阳性对照片由武汉博士德生物工程有限公司提供。采用双盲阅片，半定量积分法判定结果。以细胞核、细胞膜或细胞质呈黄色颗粒为阳性，每张切片于高倍镜下选10个视野，每个视野计数100个细胞，阳性细胞百分比小于5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。染色呈淡黄色计1分，黄色计2分，棕黄色计3分。以上两项评分的乘积小于3分为阴性(-)，≥3分为阳性(+)。

1.3.3Western blot检测CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达水平 取对数生长期细胞，置于无血清培养液中培养过夜，提取OVCAR3细胞总蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白后脱脂，室温封闭2 h后加入一抗抗体，4 ℃过夜，TBST漂洗后，分别加二抗孵育，后用TBST漂洗，加入DAB显色液，待阳性区带显色清晰后拍照记录。

1.3.4细胞凋亡实验 选择对数生长期细胞，胰酶消化,制备成细胞悬液，计数板计数，取含10万个细胞以上的细胞悬液，PBS溶液重悬加入Annexin溶液混匀，室温避光孵育10～15 min，离心，PBS 洗涤细胞，重悬细胞，加入碘化丙啶(PI)染色细胞，4 ℃下避光孵育20 min，流式细胞仪分析凋亡率。

2 结 果

2.1CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3在恶性组及良性对照组中的表达 免疫组织化学染色显示恶性组CXCR4、Bcl-2的表达高于良性对照组，Bax表达低于良性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；caspase-3在恶性组和良性对照组中的表达差异无统计学意义(P>0.05)；恶性组CXCR4蛋白的表达与Bcl-2呈正相关(r=0.480,P<0.05)，与caspase-3蛋白表达呈负相关(r=-0.475，P<0.05)。Bax、Bcl-2之间无相关性(P>0.05)，见表1，图1。

表1 CXCR4、Bcl-2、Bax 及caspase-3在两组肿瘤中的表达(n)

图1 EXCR4、Bax、Bcl-2、caspase-3在上皮性卵巢癌中的表达(免疫组织化学×200)

项目nCXCR4-+χ2PBcl-2-+χ2P年龄(岁)0.4420.6471.0910.296 ≤603415191222 >6053232病理分级(期)9.6120.00212.4420.000 G1～G21111092 G3281711622病理类型1.5320.3180.3600.548 浆液性3515201421 黏液性43113淋巴结转移14.3150.00011.8300.001 阴性18144126 阳性21417318大网膜转移7.6390.0067.8310.005 阴性13103 94 阳性26818620腹水癌细胞0.1990.7527.4620.006 阴性1899117 阳性21912417临床分级(级)7.6390.0060.0110.918 Ⅰ+Ⅱ13103914 Ⅲ+Ⅳ26818610CA125(IU/L)5.3720.0352.368 0.124 ≥353212201418 <3576116

续表2 上皮性卵巢癌组织中CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3的表达与临床病理特征的关系

续表2 上皮性卵巢癌患者中CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3的表达与临床病理特征的关系

2.2CXCR4、Bcl-2、Bax和caspase-3在上皮性卵巢癌中的表达与临床病理特征的关系 CXCR4在上皮性卵巢癌组织中的表达与病理分级、淋巴结转移、大网膜转移、临床分期、CA125水平有关(P<0.05)；与年龄、病理类型、腹水中是否找到癌细胞无关(P>0.05)；Bcl-2在上皮性卵巢癌组织中的表达与病理分级、淋巴结转移、大网膜转移、腹水中是否找到癌细胞有关(P<0.05)；与年龄、病理类型、临床分期、CA125水平无关(P>0.05)。Bax 在上皮性卵巢癌组织中的表达与淋巴结转移、CA125水平有关(P<0.05)；与年龄、病理类型、临床分期、腹水中是否找到癌细胞、大网膜转移、病理分级无关(P>0.05)；caspase-3在上皮性卵巢癌组织中的表达与病理分级、淋巴结转移、临床分期有关(P<0.05)；与年龄、病理类型、大网膜转移、腹水中是否找到癌细胞、CA125水平无关(P>0.05)，见表2。

A:Western blot图；B：定量分析图；a:P<0.05;b:P<0.01

图2不同浓度AMD3100对卵巢癌细胞CXCR4的

蛋白表达水平的影响

A：Western blot图；B～D：Bax、Bcl-2、caspase-3定量分析图；a:P<0.05;b:P<0.01

图3不同浓度AMD3100对卵巢瘤细胞Bax、Bcl-2及caspase-3的蛋白表达情况

2.3不同浓度AMD3100对卵巢癌细胞CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达的影响 与阴性对照组比较，AMD3100 10 μg/mL组、AMD3100 100 μg/mL组CXCR4蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与阴性对照组比较，Bax、caspase-3蛋白表达升高，而Bcl-2蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05),见图2、3。随着AMD3100浓度增大，Bcl-2/Bax值变小，见图4。

2.4不同浓度AMD3100对卵巢癌细胞凋亡的影响 与阴性对照组比较，AMD3100 10 μg/mL组、AMD3100 100 μg/mL组细胞凋亡率增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图4 不同浓度AMD3100对卵巢癌细胞Bax/Bcl-2的影响

A：阴性对照组；B:AMD3100 10 μg/mL组;C:AMD3100 100 μg/mL组;D:凋亡分析图；a:P<0.05;b:P<0.01

图5流式细胞术检测OVCAR3细胞凋亡

4 讨 论

卵巢癌是女性患者中常见的癌症，超过半数以上的卵巢癌病理类型为上皮性卵巢癌。该病起病隐匿，大多数患者初次就诊时即为晚期，且十分容易转移[4]，其病死率占妇科恶性肿瘤的第1位。可见，了解相关的分子调控机制在卵巢癌的发生发展过程中有积极意义。研究发现卵巢癌细胞会高表达趋化因子受体CXCR4，其与配体趋化因子CXCL12构成的 CXCL12-CXCR4 生物学轴，与肿瘤细胞的增殖、散播、免疫排斥反应及肿瘤的新生血管形成有关[5-7]，因此，本研究检测在人体上皮性卵巢癌组织中CXCR4及相关凋亡因子的表达，同时利用CXCR4的抑制剂AMD3100，在细胞实验中靶向阻断CXCR4后观察其对卵巢癌细胞凋亡的影响。

细胞凋亡是一种细胞主动性死亡方式。现在认为肿瘤可能是细胞凋亡通路受阻，使本该死亡的细胞继续存在产生的。常见的凋亡基因有Bcl-2家族、p53家族和caspase家族等。目前已经发现的Bcl-2家族按功能可分为两类，一类具有抑制凋亡作用，如Bcl-2；而另一类具有促进凋亡作用，如Bax。研究表明激活Bax基因能促进SKOV3细胞凋亡[8]，Bcl-2对大鼠海马神经元凋亡有抑制作用[9]。caspase-3作为凋亡caspase依赖途径中的中心分子，对调亡过程起着级联放大作用，是大家公认的细胞凋亡下游关键执行者，有研究发现它能有效地阻止血管新生，从而阻止肿瘤的发展。本研究发现上皮性卵巢癌组织CXCR4、Bcl-2的表达高于良性肿瘤组织，Bax表达低于良性肿瘤组织，差异有统计学意义(P>0.05)；说明CXCR4、Bcl-2、Bax的表达与肿瘤的发生有密切关系。研究表明表达CXCR4的SGC7901胃癌细胞在 CXCL12 的作用下可能激活 PI3K/Akt 信号途径，增强胃癌细胞的抗凋亡作用[10]。通过下调卵巢癌细胞株中CXCR4 的表达，能促进卵巢癌细胞的凋亡，并能有效地降低卵巢癌细胞的侵袭能力[11]。笔者推测CXCR4的高表达可以降低细胞的凋亡能力，从而参与了肿瘤的发生发展及侵袭转移。本研究在进一步研究CXCR4及凋亡相关因子的表达水平与患者临床病理特征的关系时发现CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3在上皮性卵巢癌组织中的表达均与淋巴结转移有关，而淋巴结转移是评定卵巢癌预后的重要指标之一，说明4者均参与了上皮性卵巢癌的侵袭与转移。相关性分析发现CXCR4蛋白的表达与Bcl-2呈正相关，而与caspase-3蛋白表达呈负相关，说明CXCR4可能通过某种途径来调控Bcl-2与caspase-3，此结果与有关报道相一致[12-13]。

AMD3100是一个高度特异性的细胞因子受体拮抗剂，选择性抑制CXCL12与CXCR4结合，阻断CXCL12、CXCR4生物轴的生理功能，从而抑制肿瘤的发生发展[14]。在本研究中，采用Western blot检测CXCR4的表达，发现随着AMD3100浓度的增大，CXCR4的表达明显受到抑制，再次证实了AMD3100可以靶向阻断CXCR4的表达。同样有研究发现AMD3100作用人淋巴瘤细胞株Ramos细胞后，随着药物浓度的增加，对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，凋亡增加[15]。AMD3100能够诱导乳腺癌细胞及直肠癌细胞的凋亡，并能有效地降低其增殖与迁移能力[16]。也能够引起骨髓细胞的凋亡的同时减少肿瘤血管的灌注[17]。说明CXCR4可能通过某种路径对凋亡基因进行调控，从而参与肿瘤细胞凋亡过程。张丹等[18]研究发现降低Bcl-2/Bax比值可诱导SMMC-7721细胞凋亡，抑制细胞增殖可能的机制为Bcl-2/Bax值相当于启动细胞凋亡的“分子开关”，Bax增高可促进细胞凋亡；Bcl-2升高可抑制细胞凋亡。因此，有研究推断，Bcl-2与Bax的比值决定着细胞受凋亡刺激后的生存能力。在本研究中，通过流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示：随着AMD3100浓度的增大，Bcl-2/Bax值变小，细胞凋亡率增加。caspase-3在机体中与别的凋亡蛋白家族成员发挥相互作用，通过降解凋亡抑制蛋白Bcl-2，激活caspase家族成员发生水解，产生级联反应，最终导致DNA在核小体连接处被分割成DNA链接片段，细胞凋亡由此发生。在本研究中，随着AMD3100浓度的增加，caspase-3的表达增加，细胞凋亡明显增加，此结果与庞雪利等[19]研究结果相一致。故可推测，CXCR4可能通过某种途径调控Bax/Bcl-2值的变化，同时上调caspase-3的表达，因此笔者推测阻断CXCR4的表达，可以诱导细胞的凋亡。

卵巢癌是妇科高发的恶性肿瘤之一，治疗后易复发的特点是临床治疗的一个难点。本研究表明，利用特异性抑制剂AMD3100对CXCR4进行靶向阻断，增加了细胞凋亡，其机制可能是通过阻断CXCR4后抑制凋亡相关蛋白Bcl-2的表达，同时促进Bax、caspase-3表达实现的。这或许能成为卵巢癌治疗的一个新的理论依据，但其确切的作用机制有待进一步深入研究。