李硕果，贾瑞诺，高社干

(河南科技大学第一附属医院肿瘤内七科，河南洛阳 471003)

自幽门螺杆菌在胃癌的中的作用被发现后[1]，多种病原菌与癌症的关系已经被报道，包括伤寒沙门氏菌与胆囊癌[2]，痤疮丙酸杆菌与前列腺癌[3]，大肠杆菌与结肠癌[4]等。 食管癌是第8位常见的恶性肿瘤，在癌症死因中排第6位。大部分发生在亚洲，尤其是中国[5]。 它有两种主要的组织学亚型，包括鳞癌和腺癌,且早期诊断困难，病死率高。因此，减少发生和降低病死率是必要的。

慢性牙周病的微生物群中含有丰富的革兰阴性厌氧菌。其中，牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis,PG)是一种关键的口腔致病菌，它能侵入上皮细胞，干扰宿主免疫反应和细胞周期[6-7]。流行病学表明牙周病和牙齿的缺失及某些癌症有关，比如口腔癌、胃癌、胰腺癌[7-10]。口腔鳞癌细胞中，PG通过激活ERK1/2-Ets1、p38/HSP27和 PAR2/NF-κB通路进而诱导MMP-9 表达促进了细胞迁移[10]。因为食管黏膜在组织学上与口腔黏膜相似，因此笔者认为口腔疾病可引起食管感染，PG 可能与食管癌有关。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究经本院伦理委员会批准，并取得患者书面知情同意。选择2010-2014年本院接受手术治疗的食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者100例，患者术前均未接受放化疗，并取相应癌旁组织(距离癌组织3 cm以上)；另外30例活检标本取自胃镜检查时，且病理证实为正常食管黏膜组织。4 μm厚连续切片，进行免疫组织化学SP法染色观察。

1.2试剂和方法 SP超敏免疫组织化学试剂盒购于福州迈新公司。兔抗人PG蛋白多克隆抗体和鼠抗人Lys-gingipain(Kgp,PG分泌的独特蛋白酶，批号15C8G5E6C2)单克隆抗体由美国路易斯维尔大学实验室获赠被用于检测PG感染。抗兔IgG 和正常鼠 IgG 被作为阴性对照。PG及Kgp原始抗体稀释浓度为1∶1 000及1∶500。

1.3结果评估 每个组织切片由两位资深的病理学专家评估。结果判定按阳性细胞百分率评分：<10%为0分，10%～<30%为1分，30%～<60%为2分，≥60%为3分。≥2分被看做PG或Kgp染色阳性。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0软件分析数据，计数资料采用χ2检验，随访30个月，以死亡为终点事件，生存分析采用Kaplan-Meier法并用Log-rank检验，生存状态影响因素分析采用COX回归。以P<0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PG蛋白在ESCC组织中高表达 PG蛋白在ESCC组织及癌旁组织中高表达，且在ESCC组织(60%)中的表达高于癌旁组织(15%)，在正常食管黏膜中不表达(P<0.01)，见表1。PG蛋白的表达主要定位于细胞质，偶尔也位于细胞核，见图1。

2.2Kgp在ESCC组织中表达 Kgp在ESCC组织中表达 (68%)明显高于癌旁组织(40%)，且在正常食管黏膜中不表达(P<0.01)，见表1。Kgp的表达也主要定位于细胞质，偶尔也位于细胞核，见图2。

表1 PG蛋白及Kgp在食管癌中的表达及与临床病理的关系[n(%)]

A：高分化；B：中分化；C：低分化；D：正常食管黏膜

图1 PG蛋白在食管癌中的阳性表达(SP×400)

A：高分化；B：中分化；C：低分化；D：正常食管黏膜

图2 Kgp在食管癌中的阳性表达(SP×400)

2.3PG蛋白表达与ESCC临床病理特征呈正相关 PG蛋白及Kgp的表达均与患者的年龄、性别、有无吸烟史无关，与分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关(P<0.05)，见表1。

2.4PG蛋白和Kgp表达的相关性 100例ESCC组织标本中，58%的标本PG蛋白和Kgp均为阳性(表2)。PG蛋白的表达与Kgp的表达呈正相关(P<0.01，r=0.601)。

表2 PG蛋白与Kgp表达之间的关系(n)

2.5PG蛋白、Kgp表达与ESCC的总生存相关性 根据染色情况，将PG蛋白和Kgp的表达归为两组：阴性表达组和阳性表达组，分析PG蛋白和Kgp与预后之间的关系，绘制Kaplan-Meier生存曲线。PG蛋白阳性表达组30个月生存率为44.4%，低于阴性表达组的71.9%，差异有统计学意义(χ2=8.392，P=0.004)，同时COX回归多因素分析显示淋巴结转移是ESCC患者累积生存率的独立预后因素(Waldχ2=9.232，P=0.002)。同时，Kgp阳性表达组30个月生存率为55.3%，低于阴性表达组的83.3%，差异有统计学意义(χ2=4.050，P=0.044)，COX回归多因素分析显示淋巴结转移是ESCC患者累积生存率的独立预后因素(Waldχ2=6.497，P=0.011)，见图3。

图3 食管癌组织中PG及KGP表达水平与患者预后的关系

3 讨 论

流行病学研究已证实细菌感染能够增加某些肿瘤的罹患风险，如幽门螺杆菌和胃癌[1]，中国食管癌高发区林州人群随访发现牙齿缺失与ESCC发生呈正相关，而PG蛋白感染及口腔微生态失衡是慢性牙周炎和牙齿脱落的主要致病菌[11]。越来越多证据表明：PG蛋白与多种消化道、呼吸道肿瘤的发生、发展相关[7-10]。目前有关研究认为：口腔关键致病菌之一的PG蛋白数量异常增加是造成口腔局部微生态失衡的重要因素之一。与口腔紧邻的消化管道食管上皮均为鳞状上皮，不可避免成为口腔细菌的定植场所之一。

本研究发现PG作为一个潜在的病原体，在ESCC患者的食管黏膜中不仅能被检测到，并且PG蛋白在ESCC组织中的表达明显高于相应癌旁组织，而在正常食管黏膜中不表达，PG低分化组表达明显高于中高分化组(P=0.025)，淋巴结转移组的表达率高于无淋巴结转移组(P=0.029)，Ⅲ期患者表达阳性率高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P=0.036)，PG分泌的独特蛋白酶Kgp亦有同样的表达趋势。因此笔者认为，PG的表达与多种病理因素有关，包括分化、转移、TNM分期、总生存。这些发现表明PG感染可能是ESCC的一个新的危险因素，也许是食管癌的预后靶标之一。

PG和宿主细胞相互作用的许多方面提示了PG可能介导机体的癌变过程[12]。(1)慢性炎症与肿瘤的发展有关，比如，已知增加IL-6和STAT3活性可以促进肿瘤发生[13-14]。有关研究表明PG激活JAK2和GSK3β通路，从而增加了上皮细胞中IL-6的产生[13]。(2)PG也通过多种途径产生抗凋亡作用，包括Jak1/Akt/STAT3的活化，增加Bcl-2 (抗凋亡)∶Bax(促凋亡) 的值，阻碍细胞凋亡效应器细胞色素C的释放，以及下游凋亡蛋白酶的活化。(3)PG能上调微RNAs(micro-RNAs)，例如miR-203在牙龈上皮细胞中可以抑制凋亡[15]。同样的PG能通过激活cyclin/CDK加快细胞周期进程，减少肿瘤抑制因子p53的水平。(4)PG可能诱导致癌物质产生，例如，PG可以将乙醇转化为致癌物质乙醛，可诱导 DNA损伤、突变和上皮增生，这可以解释饮酒与某些癌症发生的流行病学证据[7]。

PG可能促进了食管上皮细胞的转化。本研究结果表明PG感染与ESCC发生呈正相关，PG作为ESCC新的病原体或辅助因子，其意义是巨大的，它暗示了改善口腔卫生可能降低ESCC的危险性，筛查牙垢PG也许能辨别易感人群，应用抗菌药物或者其他的抗菌方法也许能够预防ESCC的进程。

PG感染与ESCC的关系暗示了真核细胞溶解酶可能成为ESCC的一个新的有效治疗方法。最后，PG感染促进了口腔益生菌的共生转化，这个过程对于牙周疾病的进展是重要的[16]。食管黏膜微生态失调也许能引起或加速食管病变[6]。因此，结果表明在ESCC发展中感染PG可能会导致食管微生物态的变化。

总之，本研究表明PG存在于ESCC患者的食管上皮细胞中，PG感染与ESCC的严重程度及差的预后有关，且与ESCC的进展有关。PG可能是食管癌的生物标志物之一。重要的是，这些数据表明，根除口腔致病菌可能有助于ESCC的治疗。