李 灿，唐利军，茹 琴，周 梅，李超英*

（1.江汉大学 武汉生物医学研究院，湖北 武汉 430056；2.湖北省疾病预防控制中心，湖北 武汉 430073）

戒毒一号是江汉大学武汉生物医学研究院临床效验方，由延胡索、党参、西洋参、甘草、茯苓、白术、黄芪、当归8味中药组成，各单味药对应的剂量分别为10 g、15 g、3 g、10 g……。其中延胡索是君药，具有活血、行气、息风止痛的功效；白术、茯苓、西洋参、甘草、党参五药配伍，辅助君药，具有活血行气，温经止痛的功效，共为臣药；当归、黄芪二药配伍，具有气血双补的功效，共为佐使药。诸药配伍，主要用于对甲基苯丙胺类新型毒品成瘾患者的脱毒治疗，具有良好的镇静、安神作用。高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）指纹图谱广泛运用于中药材和中成药质量控制的研究［1-3］。为了更好地保证戒毒一号临床疗效稳定、安全可控，本研究通过分析戒毒一号中各代表成分的含量及对应的药理作用，选定戒毒一号中的有效成分延胡索甲素、延胡索乙素、小檗碱、甘草酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1作为考察指标，应用高效液相色谱法对10批次戒毒一号样品进行分析比较，寻找上述指标之间的关系，建立中药复方戒毒一号的指纹图谱，为戒毒一号的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Thermo Ulti Mate 3000高效液相色谱仪（Ulti-mate-3000 RS四元泵、TCC-3000 SD柱温箱、DAD-3000检测器，20 μL定量环的手动进样、Chorme Leon 7.0色谱工作站），TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂），真空干燥机（上海豫明仪器有限公司），KQ200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），SZ-97自动三重纯水蒸馏仪（上海亚荣生化仪器厂），JYH-B40Q1中药煎煮机（广东小熊电器有限公司），BSA223S千分之一分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司），SK-20 pH计（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试剂

甲醇（批号 M158-4）、乙腈（批号 M157-4）、三乙胺（批号 M182）、乙酸（批号 M041978）三乙胺（批号M38810）均为色谱纯，均购于北京迈瑞达科技有限公司，水为超纯水（由SZ-97自动三重纯水蒸馏仪制得），其他试剂均为分析纯。戒毒一号10批样品（武汉生物医学研究院提供，批号分别为1704102、1704103、1704104、1704222、1704223、1704224、1705066、1705067、1705068、1705069（批号命名方式为：XX-XX-XX-X，年-月-日-批次）。

1.3 对照品

延胡索甲素（Corydaline，批号 518-69-4）、延胡索乙素（dl-Trtrahydropalmatine，THP，批号#6024-856）、小檗碱（Brerberine，批号 2086-83-1）、甘草酸（Glycyrrhizic acid，批号 1405-86-3）、人参皂苷Re（Ginsenoside Re，批号 #52286-59-6）、人参皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1，批号 #41753-43-9）标准品均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%。

2 方法

2.1 延胡索乙素、延胡索甲素、小檗碱、甘草酸色谱条件的选择

色谱柱：Ultimate TM XB-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水-磷酸缓冲盐（0.005 mol∕L的磷酸氢二钠溶液，以0.005 mol∕L的磷酸氢二钠调节pH至8.0，再以0.1%醋酸水溶液（三乙胺溶液调节pH为6.4），采用梯度洗脱（0～20 min 5%～20%乙腈和95%～80%0.2%磷酸，20～40 min 20%～30%乙腈和80%～70%0.2%磷酸，40～55 min 30%～60%乙腈和70%～40%0.2%磷酸，55～60 min 60%～80%乙腈和40%～20%0.2%磷酸，60～65 min 5%乙腈和95%0.2%磷酸）柱温：30℃；体积流量：1 mL∕min；检测波长：280 nm；进样量：20 μL，记录65 min内的图谱。

2.2 人参皂苷Re、人参皂苷Rg1色谱条件的选择

色谱柱：Ultimate TM XB-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：以乙腈-纯水，二元梯度洗脱（0～20 min 18%～22%乙腈和82%～78%纯水，20～30 min 22%～32%乙腈和78%～68%纯水，30～45 min 32%～34%乙腈和68%～66%纯水，45～50 min 80%乙腈和20%纯水，50～55 min 18%乙腈和82%纯水）色谱柱柱温：30 ℃；流动相：体积流量：1 mL∕min；检测波长：203 nm；进样量：20 μL，记录55 min内的图谱。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取戒毒一号中延胡索、党参、西洋参等8味中药，总重量为94 g，置于1 400 mL纯水浸泡30 min后，用中药煎煮机大火加热1 h，再文火煮沸3 h后分离煎出液，用旋转蒸发仪将煎出液浓缩至400 mL即得所需浓度药液。取10 mL药液并进行真空冷冻干燥处理。将干燥后的样品，加10 mL 80%甲醇溶解，并在50 kHz，120 W条件下超声40 min后离心，取上层清液过0.45 μm微孔滤膜滤过。重复上述操作10次，即得10个不同批次的供试品。

2.4 标准品溶液的制备

电子分析天平分别精密称取延胡索甲素、延胡索乙素、小檗碱、甘草酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1标准品0.5、10、10、50、10、10 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容至刻度，摇匀后放置，即得浓度为0.05 mg∕mL延胡索甲素、1 mg∕mL延胡索乙素、1 mg∕mL小檗碱、5 mg∕mL甘草酸、1 mg∕mL人参皂苷Re、1 mg∕mL人参皂苷Rb1标准品储备液。

3 结果与分析

3.1 方法学验证

3.1.1 线性关系考察 分别精密吸取2.3项下各标准品溶液各1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容至刻度，配制成含有不同浓度延胡索甲素、延胡索乙素、小檗碱、甘草酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1混合标准品溶液，吸取20 μL分别进样3次，按照2.1项下的色谱条件，以封面积值（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标进行线性回归，得各指标线性回归方程分别为：延胡索甲素Y=0.352 6X+0.849（R2=0.998 5），延胡索乙素Y=0.157X+0.935 3（R2=0.998），小檗碱Y=0.488 2X+3.488 9（R2=0.999 7），甘草酸Y=0.010 2X+0.175 2（R2=0.998 1），人参皂苷ReY=0.179 5X+0.096 7（R2=0.998 2），人参皂苷Rb1Y=0.083 1X+0.451 6（R2=0.998 2）。结果表明，延胡索甲素、延胡索乙素、小檗碱、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1均在1～167 μg∕mL浓度线性范围内峰面积积分值呈较好线性关系。

3.1.2 精密度试验 取2.3项下的供试品溶液，按2.1、2.2项下色谱条件连续测定6次，结果显示共有峰的相对保留时间RSD均小于0.51%，共有峰的相对峰面积RSD均小于1.06%，说明仪器的精密度良好。

3.1.3 专属性试验 用手动进样环精密吸取10 μL甲醇溶剂，注入高效液相色谱仪，记录180 min内的色谱峰。结果显示，甲醇对戒毒一号的指纹图谱中共有峰检出无影响，专属性较好。

3.1.4 稳定性试验 取2.3项下同一批次的供试品溶液注入高效液相色谱仪，并在第一次进样后的3、6、9、12、24 h各进样1次，按2.1、2.2项下色谱条件测定，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好，12次检测的图谱结果显示共有峰的相对峰面积RSD均小于1.03%，共有峰的相对保留时间RSD均小于0.45%。

3.1.5 重现性试验 取2.3项下同一批次供试品溶液平均分成6等份，按2.1、2.2项下色谱条件进行测定，检测结果显示共有峰的相对峰面积RSD均小于1.01%，且共有峰的相对保留时间RSD均小于0.54%，说明本方法的重现性好。

3.2 戒毒一号HPLC指纹图谱的确立

按照2.1、2.2项下色谱条件对10批戒毒一号供试品进行测定，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件处理各供试品所得的指纹图谱，生成戒毒一号HPLC指纹图谱共有模式。并标定了19个稳定性和重复性好、吸收强、特征明显的色谱峰为共有峰，10批戒毒一号供试品和对照品的色谱叠加图普见图1。从指纹图谱结果中发现，S7号峰高度适度、峰型对称、分离度较好，因此选择S7号峰作为参照峰。10批样品平均相似度为0.979，各共有特征峰相对面积占总峰面积的74.43%，说明10批戒毒一号的HPLC指纹图谱相似度良好。

图1 10批不同戒毒一号样品的指纹图谱Fig.1 High performance liquid chromatographic fingerprints of 10 batches of JDYH samples

3.3 戒毒一号指纹图谱中特征峰的归属分析

取戒毒一号中单味药材，按戒毒复方的煎煮及供试品制备方法制备药材溶液；同时取延胡索甲素、延胡索乙素、小檗碱、甘草酸、人参皂苷Re、Rb1对照品用甲醇稀释成适当质量浓度；按照2.1、2.2项下色谱条件进样测定，结果见图2。通过比较各色谱峰保留时间并对比图1确定各峰的来源。其中19个共有峰在对应的药材具有明显的归属感，其中9～17号峰与延胡索药材有明显的归属性，1～5号峰为党参药材的归属峰，4～8、18号峰是甘草药材的归属峰。其中11、13、15号峰是延胡索药材中的有效成分延胡索甲素、延胡索乙素、小檗碱，18号峰是甘草中的有效成分甘草酸。

图2 戒毒一号指纹图谱特征峰归属Fig.2 Characteristic peaks of fingerprints of JDYH

3.4 戒毒一号中各检测指标的含量测定

经测定中药戒毒复方，每毫升中药复方水煎剂中，延胡索甲素含量为28.33 μg，延胡索乙素的含量为27.66 μg，小檗碱含量为 3.18 μg，甘草酸含量为381.98 μg，人参皂苷Re为 279.06 μg，人参皂苷Rb1为196.47 μg。图3为中药戒毒复方样品中，延胡索甲素、延胡索乙素、小檗碱、甘草酸的含量测定图谱。图4为中药戒毒复方样品中，人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量测定图谱。

图3 戒毒一号中延胡索甲素、延胡索乙素、小檗碱、甘草酸指纹图谱Fig.3 High performance liquid chromatographic fingerprints of corydaline，tetrahydropalmatine，berberine and glycyrrhizic acid

图4 戒毒一号中人参皂苷Re、人参皂苷Rb1指纹图谱Fig.4 High performance liquid chromatographic fingerprints of ginsenoside Re and ginsenoside Rb1

4 结论与讨论

指纹图谱的大信息量克服了中药复方成分复杂难以确定的难题，是国际公认控制中药材质量的常用手段［4］。戒毒一号是多组分制剂，疗效也是多靶点作用的综合结果，所以测定的指标性成分越多，对于控制中药制剂的内在质量越有利。已知戒毒一号中含有延胡索甲素、延胡索乙素、小檗碱、甘草酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1等有效成分，采用HPLC法测定并查阅相关文献报道，将上述成分作为指标性成分，既可以增加质量控制的覆盖面，又可克服药材中所含若干种成分多少无固定比例规律的缺陷［5-11］。从10批戒毒一号样品的高效液相指纹图谱可以看出，不同批次的戒毒一号各色谱峰的相对保留时间基本一致，所含成分基本相同，具有良好的稳定性、重现性、专属性。符合指纹图谱的要求，为戒毒一号的质量控制提供良好的依据。

延胡索作为戒毒一号中君药，镇痛、镇静效果显著，本实验室前期研究发现，单味药延胡索的有效成分延胡索乙素不仅能降低海洛因的强化行为，还能有效抑制甲基苯丙胺和吗啡依赖大鼠条件线索诱导的复吸行为［12-14］。检测结果显示其有效成分延胡索甲素含量为28.33 μg∕mL、延胡索乙素含量为27.66 μg∕mL，小檗碱含量为3.18 μg∕mL，测定实验结果专属性良好、无阴性干扰，可以作为中药戒毒复方质量控制的指标性成分。甘草、党参作为戒毒一号中占比较大的佐药，检测结果显示甘草的主要成分甘草酸含量为381.98 μg∕mL，党参的主要成分人参皂苷Re含量为279.06 μg∕mL，人参皂苷Rb1含量为196.47 μg∕mL，测定结果专属性良好、无阴性干扰、含量较高，可以作为戒毒一号质量控制的指标性成分。因此用延胡索甲素、延胡索乙素、小檗碱、甘草酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量来控制戒毒一号的质量科学、可行、有效。