任增斌，陈法志，舒常庆，李秀丽，刘克华，戢小梅

（1.武汉市农业科学院林业果树研究所，湖北 武汉 430075；2.华中农业大学 园艺林学学院，湖北 武汉 430070；3.潜江市园林局，湖北 潜江 433100）

牡丹为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）落叶灌木，原产中国，是我国十大名花之首，素有“花中之王，国色天香”美誉，历来为世人所喜爱［1］。‘凤丹’（Paeonia ostii‘feng dan’）属于牡丹早花品种，是江南牡丹品种群起源较纯的原种［2］，其生长强健、着花繁多、结籽量大，根、花、叶、种子均可被利用，兼具观赏、食用、油用、药用等多种价值。2011年国家卫生部批准凤丹牡丹种子加工的牡丹籽油为新资源食品，近几年‘凤丹’生产栽培迅猛发展，截止2016年全国栽培面积已达到6万hm2。目前影响牡丹正常生长发育的主要因素是温度［2］。高温对牡丹有抑制作用，在夏季高温干旱季节（28℃以上）会停止生长，进入短暂休眠。尤其是南方地区夏季高温多湿气候，严重影响牡丹生长，造成提早落叶［3］。因此，探究牡丹的耐热机制及提高牡丹耐热性的技术措施是南方地区牡丹研究和生产亟需解决的重大难题。

油菜素内酯（brassinolides，BR）是甾醇类植物激素，是迄今为止国际上公认的活性最高、最广谱的植物生长激素，植物经极低浓度处理就能表现出显著的生理效应［4］。表油菜素内酯（epibrassino⁃lide，EBR）作为人工化学合成的油菜素内酯类似物，有着和油菜素内酯一样极高的生理活性，广泛应用于农业生产［5］。近年来研究表明，外源EBR可提高植物对高温胁迫的抵抗能力［6］，是热胁迫缓解剂［5］。EBR已应用于茶树、番茄、大豆等植物的耐热性研究，具有提高耐热性的作用［7-9］。有关其应用于牡丹的研究未见报道。本实验以‘凤丹’牡丹为材料，叶面喷施不同浓度的EBR，比较分析其在高温胁迫下对牡丹生理生化指标及超微结构的影响，揭示外源EBR提高牡丹耐热性的生理机制，为南方地区牡丹抗高温栽培的研究与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

以‘凤丹’牡丹3年生容器苗为供试材料，分别放置于25℃恒温智能光照培养箱中，预培养15 d，将预处理好的‘凤丹’容器苗分成5组，每组10株，分别喷施0.1、0.5、1.0和1.5 mg∕L的EBR，对照组喷施等量的清水，然后置于40℃/35℃（昼∕夜）的光照温度培养箱中培养5 d，培养箱内空气湿度60%，每天定时浇水，盆栽基质含水量保持在50%左右，光照强度4 000 Lx，光暗周期为14 h∕10 h（昼∕夜）。然后采集不同处理的叶片用于相关生理生化指标的测定。

1.2 指标测定

1.2.1 生理指标测定 采集经外源EBR处理的‘凤丹’叶片用于多项生理指标的测定，测定的具体指标如下。

相对电导率：采用DDS-11型电导仪测定相对电导率，参照文献［10］的方法测定，以相对电导率表示植株的电解质渗透率；

可溶性糖含量：采用蒽酮比色法测定［11］；

可溶性蛋白含量：考马斯亮蓝G-250法［12］；

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性：采用氮蓝四唑法测定［13］；

丙二醛（malone dialdehyde，MDA）含量：采用硫代巴比妥钠（TBA）法测定［14］；

光合速率采用LI-6400光合测定仪测量净光合速率。

1.2.2 超微结构观测 高温胁迫5 d后，采集叶片进行超微结构观察，将叶片切成1 mm3左右小块，立即用3%戊二醛固定2 h以上，用0.1 mol∕L的PBS缓冲液冲洗3次，每次15 min，1%锇酸（OsO4）后固定4 h，0.1 mol∕L的PBS缓冲液冲洗3次，每次15 min，经过50%、70%、85%、95%、100%酒精梯度脱水，每次15 min，转入100%丙酮，15 min后转入含有无水硫酸钠的丙酮，15 min后过渡到树脂中浸透包埋，聚合，修块，然后在超薄切片机上切片，切片厚70 nm，经醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色后，用透射电镜观察拍照。

1.3 数据分析与处理

用Excel（2013）软件和SPSS19.0软件进行数据统计、处理及图表分析，用Duncan’s进行多重比较（P=0.05）

2 结果与分析

2.1 外源EBR处理对高温胁迫下‘凤丹’净光合速率的影响

光合作用是植物物质转换和能量代谢的关键，温度逆境对其影响很大。图1中净光合速率从左到右按顺序依次为 4.94、6.78、9.87、11.49、12.29 μmol∕m2·s，4 种浓度EBR处理净光合速率较对照分别提高37.2%、99.8%、133.3%、148.2%，均明显高于对照（P＜0.05），表明外源EBR可减缓高温对‘凤丹’光合作用的抑制。不同浓度EBR处理的净光合速率随浓度的升高而升高，呈正相关，其中浓度1.5 mg∕L处理的净光合速率值最高，1.0 mg∕L与1.5 mg∕L的净光合速率差异不明显，但显著高于其他两个低浓度处理。

图1 EBR对高温胁迫下‘凤丹’净光合速率的影响Fig.1 Effect of epibrassinolide on net photosynthetic rate of′Fengdan′under high temperature stress

2.2 外源EBR处理对高温胁迫下‘凤丹’可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响

植物体内的可溶性糖含量反映了细胞受逆境胁迫的程度，在热胁迫条件下，可溶性糖含量越高，细胞受到的损害程度越高。图2中可溶性糖含量从左到右按顺序依次为42.74、32.32、24.49、20.12、19.83 μg∕g，4种浓度EBR处理可溶性糖较对照分别降低24.4%、42.7%、52.9%、53.6%，均显著低于对照（P＜0.05），表明外源EBR处理可降低可溶性糖的含量，降低了高温对凤丹的伤害。不同浓度处理的‘凤丹’可溶性糖含量随浓度的升高而降低，呈负相关，其中浓度1.5 mg∕L处理可溶性糖含量最低，1.0 mg∕L和1.5 mg∕L之间差异不显著，与其他两个浓度差异显著。

图2 EBR对高温胁迫下‘凤丹’可溶性糖含量的影响Fig.2 Effect of epibrassinolide on soluble sugar content of′Fengdan′under high temperature stress

可溶性蛋白主要参与植物体内细胞渗透势的调节，可以有效增加植物对细胞渗透势的调节作用，提高植物的耐热性。图3中可溶性蛋白含量从左到右按顺序依次为10.63、12.94、13.73、16.29、14.87 mg∕g，4种EBR处理可溶性蛋白含量较对照分别提高21.7%、29.2%、53.2%、39.9%，均明显高于对照（P＜0.05），表明外源EBR可有效抑制可溶性蛋白含量降低，从而降低了高温对‘凤丹’的伤害。不同浓度的EBR处理对可溶性蛋白含量影响随浓度增加，呈现先上升后下降的趋势，其中浓度1.0 ml∕L的处理可溶性蛋白含量最高，效果最好。

图3 EBR对高温胁迫下‘凤丹’可溶性蛋白含量的影响Fig.3 Effect of epibrassinolide on soluble protein content of′Fendan′under high temperature stress

2.3 外源EBR处理对高温胁迫下‘凤丹’相对电导率和丙二醛含量的影响

相对电导率是反映细胞膜通透性的重要指标之一，高温影响脂膜的透性，导致电解质渗透量增加。图4中相对电导率按顺依次为68.13%、55.71%、46.86%、36.19%、42.89%，4种浓度EBR处理‘凤丹’的相对电导率均显著低于对照，分别比对照低18.2%、31.2%、46.9%、37.0%，表明外源EBR处理可减缓‘凤丹’叶片电解质的渗出，抑制了相对电导率的上升，能够更好地保护细胞膜的完整性；不同浓度EBR处理的‘凤丹’相对电导率随着浓度增大呈现先下降后上升的趋势，其中1.0 mg∕L处理显著低于其他3个处理，效果最好。

图4 EBR对高温胁迫下‘凤丹’相对电导率的影响Fig.4 Effect of epibrassinolide on relative electrical conductivity of′Fengdan′under high temperature stress

丙二醛是膜脂过氧化的产物，其含量高低可以表明膜脂受破坏的程度［15］。图5中丙二醛含量从左到右按顺序依次为0.501、0.319、0.268、0.115、0.323 μmol∕g，4 种浓度的EBR 处理丙二醛含量分别比对照降低36.3%、46.5%、77.0%、35.5%，均显著低于对照（P＜0.05），表明外源EBR可缓解膜脂过氧化的过程，有效降低了丙二醛的积累。不同浓度的EBR处理对‘凤丹’的丙二醛含量影响程度不一样，随着浓度增大，丙二醛的含量呈现先下降后上升的趋势，其中1.0 mg∕L处理丙二醛含量最低，仅为对照的23%，效果最好。

2.4 外源EBR处理对高温胁迫下‘凤丹’SOD活性的影响

当植物在受到高温胁迫条件下，能够产生SOD消除大量积累的超氧阴离子自由基，保护细胞内的组织免受氧化伤害。图6中SOD活性从左到右按顺依次为1 246.21、1 673.92、2 039.91、2 475.63、2 039.43 U∕g。4种浓度外源EBR处理SOD活性较对照分别提高了32.3%、63.7%、98.7%、63.6%，均明显高于对照（P＜0.05），表明外源EBR可有效抑制‘凤丹’SOD活性的降低，可以保持较高的SOD活性，降低了高温对‘凤丹’的伤害。不同浓度的EBR处理SOD活性随浓度增加呈现先上升后下降的趋势，其中1.0 mg∕L处理‘凤丹’的SOD活性最强，较对照提高98.7%，效果最好。

图5 EBR对高温胁迫下‘凤丹’丙二醛含量的影响Fig.5 Effect of epibrassinolide on MDA content of′Fengdan′under high temperature stress

图6 表EBR对高温胁迫下‘凤丹’SOD活性的影响Fig.6 Effect of epibrassinolide on SOD activity of′Fengdan′under high temperature stress

2.5 外源EBR处理对高温胁迫下‘凤丹’超微结构的影响

如图7（A～E）所示，高温胁迫下‘凤丹’细胞结构均有不同程度的破坏，对照组（图7A）中细胞膜已破裂，叶绿体膨大变圆，叶绿体膜破裂，内容物外泄，叶绿体中出现大小不一的空洞；线粒体解体；有大量的淀粉粒和磷脂球体的出现，且体积较大。外源EBR处理的‘凤丹’叶片细胞结构也有不同程度的破坏，但均明显比对照轻，其中1.0 mg∕L（图7D）处理细胞结构受损程度最轻，其细胞膜边界清晰完整，细胞内叶绿体结构较正常，呈长卵形排布在细胞膜内，叶绿体膜分界清晰，基本没有内容物流出；淀粉粒和磷脂球体数量较少；线粒体为正常的圆形；细胞核和液泡形态正常，清晰可见。说明使用外源EBR可有效保护细胞膜、叶绿体和线粒体的完整性，进一步验证了EBR有利于提高‘凤丹’的耐热性。

图7 EBR对高温胁迫下‘凤丹’超微结构的影响Fig.7 Effect of epibrassinolide on ultrastructure of′Fengdan′under high temperature stress

3 结论与讨论

近年来，由于“温室效应”现象的加剧，全球气温不断升高，整个农林业面临严重挑战，对植物的耐热性也提出了更高的要求［16］。高温胁迫下，植物会打破体系原有的动态平衡，导致氧代谢失调，造成活性氧、丙二醛的积累，改变膜的透性，严重时对植物造成致死性伤害［17］。油菜素甾醇类物质（brassinosteroids，BRs）现已是公认的第六大类植物激素［18］，其生理活性远超过现有的5种激素［19］，其主要的生理效应是促进细胞的生长和分裂，促进植物的光合作用，提高植物的抗逆性，具体表现为提高植物的抗旱［20-21］、抗盐［22］、抗热［15］、抗氧化能力［23］，在不利的自然条件下更为突出，又称为逆境条件的缓和剂［24-25］。

植株最终产量的形成基础以及植物对高温最为敏感、直接的生理反应过程都是光合作用。高温中，植物需要保持很高的光合速率。这样，植物才能保证生长和生存［26］。牡丹“喜温和、忌酷热”，且属于具有较高的光补偿点和较低的光饱和点的一类植物，对光能的有效利用范围较窄，在南方夏季强光高温环境下，其光合生理将受到胁迫［27-28］，主要表现为高温引起光合速率的下降，在叶片温度达到32℃以上时，蒸腾速率不再增加，导致叶片温度进一步上升，进而危害到植物最主要的光合器官叶片的功能［29］。在茶树、大豆、龙须菜等研究表明，外源EBR处理显著提高了高温胁迫下植物的净光合速率［7，9，30］。本研究表明，外源EBR可减缓高温对‘凤丹’光合作用的抑制，显著提高了净光合速率，增强光合能力，不同浓度EBR处理的净光合速率随EBR浓度的升高而升高，其中浓度1.5 mg∕L处理净光合速率值最高，达到12.29 μmol∕m2·s，较对照提高148.2%。

植物在高温胁迫下细胞膜伤害和脂膜透性增加是高温伤害的本质之一［31］。高温胁迫下植物会发生过氧化作用，植物体内会积累大量的过氧化产物，同时脂膜透性增大，细胞内电解质渗透压增加，继而引发电解质外渗，从而导致组织浸出液的电导率增大［32］。有研究表明，随着温度升高，牡丹叶片电导率呈现不断上升趋势，高温破坏了牡丹叶片细胞膜的透性［3］。本研究表明，外源EBR处理可减缓‘凤丹’叶片电解质的渗出，抑制相对电导率的上升，能更好地保护细胞膜的完整性，缓解膜脂过氧化的过程，有效降低丙二醛的积累，从而缓解高温对‘凤丹’的伤害。不同浓度EBR处理的‘凤丹’叶片相对电导率和丙二醛含量呈现先下降后上升的趋势，其中1.0 mg∕L处理效果最好。

自然条件下，植物体内活性氧的产生和消除会处于一种动态平衡，而遭受高温后，这种平衡会造成破坏，造成活性氧的过量积累，最终会导致植物受到不同程度的伤害［33］。SOD是植物体内抵御活性氧伤害的重要酶类之一，在清除超氧化物阴离子自由基方面起到重要作用。有研究表明，高温能促进活性氧物质的形成，钝化SOD等抗氧化酶的活性［34］。本研究表明，外源EBR处理可明显提高‘凤丹’SOD活性，其中以1.0 mg∕L处理效果最好，表明外源EBR可通过提高高温胁迫下‘凤丹’的抗氧化活性，增强清除自由基和活性氧的能力，从而缓解高温对植物的伤害。这与李治鑫等［7］在茶树、华智锐等［19］在小麦上的研究结果一致。在透射电镜下观察发现，外源EBR处理使‘凤丹’叶片保持较完整的细胞结构，可有效保护细胞膜，抑制叶绿体和线粒体的变形和解体，进一步验证了EBR可保护‘凤丹’叶片细胞膜结构，从而提高耐热性。

综上所述，外源EBR作为一种高活性的植物激素，对高温胁迫下的牡丹有较好的保护作用，可有效抑制高温对抗氧化系统和细胞膜结构的伤害，提高牡丹的耐热性，以1.0 mg∕L处理效果最好，为牡丹的抗高温栽培提供了理论基础和技术支持。EBR作为化学诱抗剂在牡丹上有较好的应用效果和应用前景。