曹君迈,马海军,谭亚萍

(北方民族大学生物科学与工程学院,宁夏 银川 750021)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)是我国荒漠地区特有的一种野生植物[1]，是西北地区一种重要的中药材，在藏药中广泛应用[2]。我国对红果枸杞的研究始于19世纪初期，而对野生黑果枸杞的研究却晚了一个世纪。有关黑果枸杞的生理生态[3-4]、各种抗性[5-6]、营养成分分析和提取[7]、药性及药理学作用[8]、抗旱价值[9]以及开发利用前景[10]等方面已有大量文献报道。正是基于学者的研究结果认为黑果枸杞的保健及药用价值远高于普通红枸杞[11]，这样导致市场对黑果枸杞的需求量剧增，同时以黑果枸杞为主要原料的药品、茶品、保健品等系列产品的开发，从而推动了黑果枸杞产业的迅速发展。面对多元化市场的需求，以及野生资源有限的局面，利用常规栽培方法已不能满足枸杞产业的快速发展，且常规栽培方法植株繁殖速度慢[12]，采用组织培养技术手段可有效提高种苗繁殖速度、缓解对野生资源破坏性的采挖。然而，关于黑果枸杞组织培养研究报道的文献较少[13-15]，缺乏系统的、深入的研究，同时还存在生产成本高，繁殖系数低[14]，不同品种之间配方差异很大等问题，给标准化的工厂化生产带来了一定难度。本研究试图以愈伤组织诱导、丛生芽诱导及叶片直接诱导小植株的再生途径为研究目的，以期探讨出黑果枸杞最佳的离体繁殖途径，建立高效的无性繁殖技术体系，为野生黑果枸杞资源的充分保护和利用以及规模化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

黑果枸杞金塔种子来自甘肃农业大学。以MS培养基作为基本培养基。

1.2 方 法

1.2.1 实验设计 实验于2015年3月-2016年4月，在北方民族大学生科院组培实验室进行。采用单因素随机区组设计，以激素为处理因素，将各种外植体接种于不同处理的培养基上，每个处理接种15瓶，剔除污染瓶后，每种处理统计10瓶，以叶、茎段、愈伤组织做外植体时，每瓶接种5个，其余材料做外植体时，每瓶接种3个。

1.2.2 无菌苗的获得

(1)种子的消毒。挑选150粒形状大小、饱满度一致的黑果枸杞种子，用蒸馏水泡后放入4℃冰箱备用。第二天取出放入已开启灭菌的超净工作台上，将种子放入装有70%乙醇的无菌培养皿中消毒5s左右，用无菌蒸馏水反复洗涤3次，再用2%的次氯酸钠溶液将种子浸泡消毒25 min，继续用无菌蒸馏水洗涤3次，洗去残余溶液，洗涤后放在灭菌滤纸上，吸干种子表面的水分。

(2)接种。将消毒后晾干的种子接入MS培养基上，每瓶培养基接15粒黑果枸杞种子，一共10瓶，编号后送入培养间进行培养。

(3)培养条件。固体培养基：白砂糖20 g·L-1，琼脂5 g·L-1，MS营养成分，pH值调至5.8～6.0；培养室温度25 ℃左右；光/暗周期15 h/9 h，光强2 000 Lx左右。

1.2.3 愈伤组织的获得 待黑果枸杞的无菌苗长到6 cm左右时，以叶片和茎段为外植体，要求规格如下：叶片为0.5～1 cm2，茎段要截取成带3片叶且高度为2 cm大小，接种到激素配比不同的7种培养基上，即：1. 2,4-D 0.1 mg·L-1、2. 2,4-D 0.2 mg·L-1、3. 2,4-D 0.3 mg·L-1、4. 2,4-D 0.4 mg·L-1、5.0 mg·L-1(无激素)、6. IBA 0.2 mg·L-1、7. NAA 0.2 mg·L-1。

1.2.4 丛生芽的获得 取长势一致且旺盛的愈伤组织，将其分割成大小约1 cm3的团块，分别接种到激素配比不同的4种培养基，即：8. 6-BA 0.5 mg·L-1、9. 6-BA 0.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1、10. 6-BA 0.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1、11. 6-BA 0.5 mg·L-1+KT 1.5 mg·L-1。

将按规格要求剪切的茎段分别接种到激素配比不同的5种培养基，即：12. 6-BA 0.2 mg·L-1、13.6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1、14. 6-BA 0.2 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1、15. 6-BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1、16. 0 mg·L-1(无激素)。

1.2.5 叶片诱导再生植株 取无菌苗叶片剪切成0.5～1 cm2，每片叶剪伤2处，分别接种于激素配比的5种培养基，即：17. 6-BA 0.01 mg·L-1+2,4D 0.01 mg·L-1、18. 2,4D 0.01 mg·L-1、19. IBA 0.01 mg·L-1、20. NAA 0.01 mg·L-1。

1.2.6 再生植株的获得 茎段或愈伤组织诱导的丛生芽，待芽长至3 cm高时，转入MS培养基形成再生植株。

1.2.7 数据的调查统计

(1)待种子萌发后一个星期内统计枸杞发芽率和污染率。

种子萌发率=发芽种子数/接种种子总数×100%

污染率=污染的瓶数/总瓶数×100%

(2)观察记录愈伤组织的生长情况，统计黑果枸杞外植体的愈伤量、出愈率和生长状况。

出愈率=产生愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%

愈伤量：++++表示愈伤组织体积是接种外植体的15-25倍；+++表示愈伤组织体积是接种外植体的10-20倍；++表示愈伤组织体积是接种外植体的5-10倍；+表示愈伤组织体积是接种外植体的0-5倍；

(3)观察记录丛生芽的生长情况，统计不同培养基对黑果枸杞愈伤组织或茎段诱导分化丛生芽的影响，筛选诱导率高且丛生芽质量好的最佳培养基。统计黑果枸杞丛生芽数、整齐度和增殖系数。

丛生芽数为接种的外植体上长出的芽个数；

整齐度：用差和齐表示，接种的外植体分化出的芽生长的高度一致即为齐，接种的外植体分化出的芽生长的高度不一致即为差；

增殖系数=增殖的芽数/接种数。

(4)观察记录叶片的生长情况，筛选叶片诱导率高且植株生长状况最好的最佳培养基及其激素配比。统计叶片分化率。

叶片分化率=产生的植株数/接种叶片总数×100%

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导

将黑果枸杞无菌苗的叶片和茎段剪切2-3个伤口后接种到表1的培养基中。培养室培养3-5 d后，茎段基部伤口处逐渐脱分化出现愈伤组织，呈紧密颗粒状。叶片约7 d后变黄，伤口处逐渐脱分化形成愈伤组织，呈疏松颗粒状。两种外植体形成的愈伤组织15 d左右开始逐渐增多，45 d左右，愈伤组织量达到最大。无论用叶片，还是茎段做外植体，1-4号处理愈伤组织诱导率均为100%；5号处理愈伤组织诱导率均为0；6号处理用叶片做外植体愈伤组织诱导率为100%，茎段做外植体愈伤组织诱导率为25%；7号处理均有所下降(见表1)。

由表1可知，无论用叶片，还是茎段做外植体，低浓度的2,4-D能诱导出愈伤组织，并且随着浓度的增加，诱导效果增强，愈伤量明显变多；处理6中IBA使叶片和茎段诱导出愈伤组织，但愈伤量少、愈伤组织上有芽的分化，而茎段有丛生芽发生；处理7中NAA诱导叶片、茎段形成了少量愈伤，愈伤组织上均有芽的分化，IBA 、NAA，诱导茎段形成愈伤组织效果最差，2,4-D有利于愈伤组织诱导。

由此可见，以2,4-D 0.4 mg·L-1诱导叶片形成的愈伤组织最佳，以培养基2,4-D 0.3 mg·L-1诱导茎段形成的愈伤组织最佳，愈伤组织诱导率均为100%。

表1 激素处理对黑果枸杞愈伤组织诱导的影响

2.2 丛生芽诱导

2.2.1 利用愈伤组织诱导丛生芽 将生长状态良好的愈伤组织转接至表2的丛生芽诱导分化培养基中，15 d左右，愈伤组织分化形成丛生芽，表面分布少量绿色丛生芽点；30 d左右，愈伤组织上的大部分绿色丛生芽点开始分化形成丛生芽(见表2)。

表2为90 d的统计结果。由表可知，当KT浓度为0，6-BA浓度为0.5 mg·L-1时，黑果枸杞丛生芽的增殖效果最好，增值系数为47.1倍。KT对丛生芽的分化没有显著的影响。

2.2.2 利用茎段诱导丛生芽 将黑果枸杞无菌苗的茎段接种到表3的培养基中。培养3-5 d后，茎段分化丛芽，且生长快速。15 d左右，茎段基部开始分化出大量幼芽组织团块。表3为60 d统计结果，不同激素及其浓度配比的培养基对黑果枸杞茎段诱导分化形成丛生芽有一定的影响。处理12芽增殖系数低，整齐度差；处理13和15虽然诱导的芽增殖系数高，但整齐度差；处理14，丛生芽整齐度好，增殖系数为32.3倍；处理16中不含激素，丛生芽诱导率为0；处理14的整体诱导丛生芽效果优于其它处理。

2.3 利用叶片诱导再生植株

将规格为0.5～1 cm2的叶片接种至表4的培养基中。表4为40 d记录结果。由表4可知处理17、 18有愈伤组织形成，无再生植株形成；其余2种处理在叶片伤口的主叶脉处均形成了芽，处理19生根率为33.3%，植株再生诱导率26.6%；处理20生根率为66.7%，植株再生诱导率33.3%。 由此可见，处理19， 0.01 mg·L-1的NAA诱导叶片形成再植株的效果较好，诱导率为33.3%。

表2 激素处理对愈伤组织形成丛生芽的影响

表3 激素处理对茎段诱导丛生芽的影响

表4 激素处理对叶片诱导植株的影响

2.4 生根培养

丛生芽高度长至3 cm时，转入MS培养基培养20 d均可长出3-4条根，幼苗生长健壮(见图1)。

3 讨 论

3.1 黑果枸杞的叶和茎段较易诱导愈伤组织

实验发现，以叶和茎段为外植体时，在MS培养基上，添加2,4-D 0.1-0.4 mg·L-1均易诱导出愈伤组织，但IBA 、NAA，不利于诱导愈伤组织。冀菲[13]利用黑果枸杞剪掉根系的无菌苗在 MS+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1培养基中可以形成较好的愈伤组织, 其结果与本实验不同。此外，本实验在低激素MS+6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1培养基中形成的是丛生芽，其结果的不同可能与品种和光照时间不同有关。

图1 MS培养基植株生根效果Fig.1 Rooting effect of plants in MS medium

3.2 选择适宜的外植体有利于丛生芽诱导

愈组诱导丛生芽的过程中，玻璃化现象严重，可能由于细胞分裂素含量高，导致增殖系数太高，迫使丛生芽生长的过程中在营养需求量大，代谢物积累增多和生长空间不足，对生长产生了不利影响。本实验光照时间为15h，曹有龙等[16]认为红果枸杞的适宜光照时间为12 h，培养瓶内湿度过大，凝结成小水滴后可能都提高了玻璃化发生率，因此，不建议利用愈组诱导丛生芽这种途径。冀菲[13]认为6-BA 高于0.6 mg·L-1时增殖率开始下降；当培养基中6-BA 质量浓度为0. 4 mg·L-1时增殖效果最好，本实验筛选出6-BA 质量浓度为0.5 mg·L-1时增殖效果最好, 与冀菲实验结果基本一致，而冀菲未提到玻璃化现象的发生。利用茎段诱导丛生芽的过程中，与愈组诱导丛生芽的培养条件相同，但未发生玻璃化现象。Sun[14]等认为利用黑果枸杞幼苗茎段为外植体时，使用6-BA易产生玻璃化苗，但本实验中采用了6-BA 0.2 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1和6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1激素配比没有产生玻璃化苗，且繁殖系数高达32倍之多，可能是组培品种不同所致。

3.3 利用叶片直接诱导再生植株

郭辉[17]认为红果枸杞叶片不能分化产生芽。马和平等[18]以“宁杞 2 号”叶片为试材，研究了其再生体系，认为红果枸杞直接从叶片上可分化产生芽，与本实验结果一致。由于品种不同激素搭配不同，黑果枸杞在单独使用IBA 0.01 mg·L-1和NAA 0.01 mg·L-1的培养基上，叶片首先在主叶脉伤口处长出根系，待根系长到一定长度后，叶片不经过脱分化的过程，直接生成再生植株，也可按马和平等方法将苗切下进行生根。这个现象初步说明了黑果枸杞叶片的再生能力较强，此途径为植物遗传转化奠定了基础。