黄 琼

（福建农业职业技术学院生物技术系，福建福州350119）

枇杷叶系蔷薇科枇杷属植物枇杷的干燥叶，又名巴叶，是传统医药学常用的中草药［1］。枇杷叶具有清肺止咳、降逆止呕的作用，临床用于治疗肺热咳嗽、胃热呕吐、气逆喘气及烦热口渴之症状［2］。近年来，国内外学者对枇杷叶的化学成分进行了系列研究，发现其含有黄酮类、挥发油、倍半萜类、三萜类等活性成分［3］。

黄酮类化合物广泛存在于天然产物中，具有多种生理学活性和药理作用，其具有抑菌、防癌抗癌、抗心率失常、抗氧化、抗衰老、抗心血管疾病、抗骨质疏松、降血脂、护肝、解肝毒、治疗急、慢性肝炎及肝硬化等功能［4-10］。枇杷叶黄酮类化合物的测定常用的方法有分光光度法和高效液相色谱法［11］。在实际科研工作中，考虑到方法的简便、快捷及可行性，多采用分光光度法测定黄酮类化合物含量。本文采用分光光度法测定枇杷叶黄酮类化合物含量，并考察枇杷叶黄酮类化合物对·OH和O2-·的清除作用，为枇杷叶的进一步开发利用提供理论依据和参考价值。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 原料

枇杷叶：于5月中旬采集于福清26度休闲农庄，经摘取、清洗，晾干，放入干燥箱干燥后，粉碎、密封保存，备用。

1.1.2 试剂

芦丁标准品：购自北京世纪奥科生物技术有限公司，（UV≥99%）；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

FS-1200N超声波处理器：上海生析超声仪器有限公司；UV-1800PC-DS2紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；ST-80索氏提取装置：北京赛福莱博科技有限公司；FZ102微型植物粉碎机：北京格拉威尔科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制

精确称取0.020 0 g芦丁标准品于100 mL容量瓶中，以60%乙醇溶解，定容，精确量取25 mL置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，即得0.1 g/L的芦丁标准溶液。用紫外可见光度计对芦丁标准品溶液和枇杷叶提取液进行190～600 nm范围内的扫描。在芦丁标准品溶液和样品溶液中均发现在310 nm处出现明显而无干扰的独立峰。因此，将310 nm作为最大吸收波长。取0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL芦丁标准溶液分别于25 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，摇匀，于310 nm处测其吸光度。以吸光度A与浓度C进行线性回归，得回归方程。

1.2.2 枇杷叶黄酮类化合物含量测定

准确称取干燥枇杷叶10.0 g，置于500 mL烧杯中，加入100 mL的70%乙醇，置于超声清洗仪中进行超声波处理，然后用转速为4 000 r/min离心机进行离心，离心15 min，离心后弃去残渣取上清液，准确移取上清液5.0 mL，置于250 mL容量瓶中，以60%乙醇溶解，定容至刻度。准确移取2.0 mL样品液，通过芦丁回归方程计算枇杷叶黄酮类化合物含量，其计算公式为：

1.2.3 加标回收率的测定

分别准确移取 0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL芦丁标准溶液（0.348 g·L-1），与 0.1 mL样品溶液（10.430 g·L-1）混合，分别用无水乙醇定容至25 mL，于310 nm处测吸光度，其计算公式为［12］：

1.2.4 枇杷叶黄酮类化合物对·OH的清除作用

准确移取 1.0 mL0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mg·mL-1样品液于 25 mL 具塞比色管中，依次加入 2 mmol·L-1的 FeSO4的 3.0 mL、6 mmol·L-1的水杨酸 3.0 mL，摇匀，再分别向各比色管中加入2 mmoL·L-1的H2O23.0 mL，摇匀，于37℃恒温水浴反应15 min，取出在波长510 nm处测得吸光度值A1，以0.0 mg·mL-1样品液吸光值为A0，计算样品液对·OH的清除率，其计算公式如下［13］：

式中：A0为空白管的吸光值；A1为样品液的吸光值。

1.2.5 枇杷叶黄酮类化合物对O2-·的清除作用

准确移取 1.0 mL 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mg·mL-1样品液 1.0 mL，再加入 5.0 mL 50 mmol·L-1的Tris-HCl缓冲液（pH=8.2），25℃水浴20 min后，取出迅速加入0.1 mL25 mmol·L-1的邻苯三酚，混匀保温10 min后，立刻加入2滴10 mol·L-1的HCl终止反应，溶液在波长325 nm处的吸光值X1，同法测定用蒸馏水代替邻苯三酚后的吸光值X2，及以1.0 mL蒸馏水替代样品溶液后的吸光值X0，来计算样品液对O2-·的清除率，其计算公式如下［14-15］

式中，X1为样品溶液吸光值；X2为蒸馏水替代邻苯三酚后的吸光值；X0为蒸馏水替代样品溶液后的吸光值。

1.3 数据分析

所有试验均重复3次，结果取平均值，试验数据采用Excel2016软件进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 枇杷叶黄酮类化合物含量测定

按1.2.1和1.2.2方法进行芦丁标准曲线的绘制和黄酮类化合物含量的测定，得芦丁标准物质含量与吸光度之间满足关系式A=9.751 4 C+5×10-5，R2=0.999 9，式中：C为芦丁质量浓度g·L-1，A为吸光度，见图1。结果表明，芦丁标准品含量在0.00～0.05 g·L-1范围与吸光度呈现良好的线性关系。根据回归方程计算出枇杷叶黄酮类化合物含量为78.86 mg·g-1。

图1 芦丁标准曲线

2.2 样品回收率

按1.2.3方法进行样品回收率实验，结果见表1。由表1可知，平均加标回收率为100.2%，RSD为0.94%。符合规定，表明紫外分光光度法可用于测定枇杷叶总黄酮含量，实验准确度较高。

表1 回收率测定结果

2.3 枇杷叶黄酮类化合物对对·OH的清除作用

按1.2.4的方法进行清除对·OH的测定，以对·OH的清除率为因变量，以样品浓度为自变量，作图，结果见图2。由图2可知，枇杷叶黄酮类化合物对·OH有清除作用，在枇杷叶黄酮类化合物质量浓度为0.2～1.4 mg·mL-1范围内，其清除·OH能力随着黄酮类化合物质量浓度增加而增强。当质量浓度为1.4 mg·mL-1时，对·OH清除率最高为82.9%。

图2 枇杷叶黄酮类化合的对·OH-清除作用

2.4 枇杷叶黄酮类化合物对O2-·的清除作用

按1.2.5的方法进行清除O2-·的测定，以对O2-·的清除率为因变量，以样品浓度为自变量，作图，结果见图3。由图3可知，枇杷叶黄酮类化合物对O2-·有清除作用，在黄酮类化合物质量浓度为0.2～1.4 mg·mL-1范围内，黄酮类化合物清除O2-·能力随着质量浓度的增加而增强。当其浓度为1.4 mg·mL-1时，对O2-·-清除率最高为77.3%。

图3 枇杷叶黄酮类化合的对O2-·清除作用

3 结论

本文采用分光光度法测定枇杷叶中黄酮类化合物含量，其含量为78.86 mg·g-1，样品回收率为100.2%，说明紫外分光光度法测定枇杷叶中总黄酮含量的分析方法是一种可行性强，适合一般实验室操作的方法。

枇杷叶黄酮类化合物能够有效清除·OH和O2-·，枇杷叶黄酮类化合物质量浓度为1.4 mg·mL-1时，其对·OH和O2-·的清除率分别为82.9%和77.3%，说明枇杷叶黄酮类化合物具有较强的体外抗氧化活性，且清除作用随枇杷叶黄酮类化合物质量浓度的增加而增强。