郭睿

摘 要：L-门冬酰胺酶（Asparaginase）是一种被收录进《中国药典》2015年版用于治疗小儿急性白血病的药物。在《中国药典》2015年版中用于检测其效价的是比色法。但出现用反相高效液相色谱法检测效价的方法，通过试验发现反相高效液相色谱法不能用于门冬酰胺酶效价检测。

关键词：L-门冬酰胺酶;效价检测

L-门冬酰胺酶（Asparaginase）是一种被收录进《中国药典》2015年版[1]用于治疗临床主要用于急性淋巴细胞性白血病，也用于急性粒细胞性白血病，急性单核细胞性白血病和恶性淋巴瘤的药物。因淋巴肿瘤细胞不能自身合成对生长必要的氨基酸门冬酰胺，必须依赖宿主供给，而门冬酰胺酶能使门冬酰胺水解，使细胞缺乏门冬酰胺，从而抑制其生长的作用。正常细胞由于能够自主合成门冬酰胺，故受影响较少。

在《中国药典》2015年版中，对于L-门冬酰胺酶的活性测定方法为终点法，即是考察一定量的蛋白酶在一定时间内水解酰胺基产生的游离铵离子的量，再将碘化汞钾与氨反应生成黄色溶液用比色法测定，根据氨量计算酶的效价。并规定每1 mg蛋白含门冬酰胺酶的活力不得低于250单位。我公司的一家印度客户则提供另一种利用反相高效液相色谱法来测定门冬酰胺酶的效价。本文主要对这两种方法进行分析研究，探索L-门冬酰胺酶效价更高效、更准确的测定方法。

1 《中国药典》2015年版中门冬酰胺酶效价检测方法

1.1 试验材料与方法

1.1.1 试验仪器

紫外-可见分光光度计、恒温水浴锅、105℃鼓风干燥箱、电子天平（感量为0.1mg）、秒表、容量瓶、吸量管、进样器。

1.1.2 试剂与药品

试剂：0.1mol/L磷酸氢二钠、0.1mol/L磷酸二氢钠、25%三氯醋酸溶液、0.0015mol/L硫酸铵溶液;

药品：门冬酰胺酶（常州千红生化制药股份有限公司，批号：47170531008C）。

1.1.3 测试方法与结果

①取试管4支（14cm×1.2cm），各加入用上述磷酸盐缓冲液配制的 0.33%门冬酰胺溶液1.9mL，于37℃恒温水浴中预热3分钟;②分别于第1管（to）中加入25%三氯醋酸溶液0.5mL，第2、3、4管（t）中各精密加入供试品溶液0.1m1，置37℃水浴中，准确反应15分钟，立即于第1管（to）中精密加入供试品溶液0.1mL，第2、3、4管（t）中各加入25% 三氯醋酸溶液0.5m1，搖匀，分别作为空白反应液（to）和反应液（t）;③精密量取to、t和对照品溶液各0.5mL置试管中，各加水7.0mL及碘化汞钾溶液1.0mL，混匀;另取试管一支，加水7.5mL及碘化汞钾溶液1.0m1作为空白对照管，室温放置15分钟，照紫外-可见分光光度法在450nm的波长处，分别测定吸光度A0、At和As，以At的平均值;④结果计算：a.以平均值分别求得标准品和供试品的ΔA值;b.按下式计算：

式中：5为反应常数;F为对照品溶液浓度的校正值。

效价单位定义：在上述条件下，一个门冬酰胺酶单位相当于每分钟分解门冬酰胺产生1μ mol氨所需的酶量。

检测结果为：129.6U/mg

第一人检测结果：

2 反相高效液相色谱法测定门冬酰胺酶效价方法

2.1 试验材料与方法

2.1.1 试验仪器

高效液相色谱仪。

2.1.2 试剂与药品

试剂：甲酸溶液、乙腈溶液;

药品：门冬酰胺酶（常州千红生化制药股份有限公司，批号：47170531008C），门冬酰胺酶标准品（中国食品药品检定研究所，批号：JMRT-J94X）。

2.1.3 测定方法与结果

2.1.3.1 色谱条件

流动相：0.1%甲酸溶液和0.1%乙腈溶液，比例为7：3;

色谱柱：4.6mm×15cm色谱柱（Hamilton色谱柱）;

检测波长：278nm;

进样量：50μl.;

流速：0.4mL/min;

柱温：室温。

2.1.3.2 溶液准备

标准品溶液：称取25mg门冬酰胺酶标准品，于50mL容量瓶中，加20-30mL水并定容至50mL，得500mcg/mL溶液。

供试品溶液：称取25mg门冬酰胺酶供试品，于50mL容量瓶中，加20-30mL水并定容至50mL，得500mcg/mL溶液。

注：①拖尾因子不得超过2.0;②重复进样检测峰面积RSD不得超过2.0%

2.1.3.3 结果计算：

检测结果：双人双份都无检出。

3 结果分析与讨论

因分析灵敏度高、分析时间短，现在越来越多的将反相高效液相色谱法用于化药的鉴别和纯度检测，但用于药品效价等活性成分的检测却很少。从此次试验也可看出，同一批门冬酰胺酶分别用《中国药典》2015年版和印度客户提供的反相高效液相色谱法，前一种方法可以很顺利检测出此批产品效价值，但后一种方法无法检测出结果。分析后认为，门冬酰胺酶是一种生物大分子，一般不耐受高浓度的有机溶剂，因此在检测流动相中会引起门冬酰胺酶高级结构的变化，从而导致活性的丧失，分子结构被降解，而无法被检测出。目前反相高效液相色谱法不能用于门冬酰胺酶效价检测。随着药物分析理论和药物检测仪器的发展，更高效、更便捷的检测方法定会出现，并迅速予以推广运用。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015.