赵海丽 吕素芳

摘要： 本试验的目的是扩增得到β-半乳糖苷酶基因启动子序列和β-半乳糖苷酶基因并反向插入pET32a载体中，构建穿梭质粒表达载体，并进行诱导表达，分析β-半乳糖苷酶基因在双启动子序列调控下的表达特征。

关键词： 大肠杆菌;β-半乳糖苷酶基因;表达载体

中图分类号： Q756    文献标识码： A    文章编号： 1672-9129（2018）09-0078-01

Abstract：  the purpose of this study was to obtain the expression characteristics of the lion-galactosidase gene promoter sequence and the lion-galactosidase gene through the reverse insertion of the pET32a vector， construct the shuttle plasmid expression vector， and conduct the induced expression， and analyze the expression characteristics of the lion-galactosidase gene under the regulation of the double promoter sequence.

Keywords： escherichia coli;β-Galactosidase gene;Expression vector

β-半乳糖苷酶，又称β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，广泛存在于各种动物﹑植物及微生物中。β-半乳糖苷酶能催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷键发生水解，还具有转半乳糖苷的作用。由于它具有糖苷键结构特异性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂，并具有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基，引起血型转化等生理功能[1]，而受到人们广泛关注，成为生物化学和酶催化化学的重要研究课题。β-半乳糖苷酶的应用有着悠久的历史，最初在食品工业中用来降解乳糖含量以满足乳糖不耐症症状患者的需要，随着生物技术的发展，它越来越多的应用于生物技术、化学、医药等领域。

1 材料与方法

1.1实验材料。

（1）菌株和克隆载体 猪大肠杆菌987P（登记号C83710）菌种，pET32a 载体。

（2）工具酶与试剂盒 各种限制性内切酶（NheⅠ、XbaⅠ）、dNTP、PCR Buffer 、Taq DNA聚合酶、RNAase、 DL15000、DL2000、IPTG均购自TaKaRa生物公司;DNA回收试剂盒购自大连宝生物工程（大连）有限公司。其他生化试剂均为化学分析纯。

1.2实验方法

（1）总DNA的快速提取 挑取单菌落到1.5ml离心管内，加20μl双蒸水后混匀，95℃水浴10min，-20℃10min，于4℃、12000rpm离心2min，取上清备用。

（2）β-半乳糖苷酶基因的PCR扩增 反应体系：模板1 μl，10×PCR buffer2.5μl，dNTP 3μl，上、下游引物各1μl，Taq DNA聚合酶 0.5μl，ddH2O 16μl。……