娄石磊，苗永迪，岂 蕊，治丁铭，孙 聪

（长春中医药大学，长春 130117）

肠纤维化是克罗恩病（CD）、溃疡性结肠炎（UC）和辐射性肠炎等多种炎症性肠病（IBD）的并发症之一。其病因主要由肠道炎症损伤修复失调和肠间质细胞过度增殖，进而导致大量的细胞外基质（ECM）沉积于肠壁，产生肠道纤维化、肠道狭窄和肠梗阻等严重后果[1-2]。随着肠纤维化研究的不断深入，成纤维细胞的功能及相应的细胞信号转导机制研究已经成为重点。黄芩苷（baicailin，C21H18011），是从唇形科植物黄芩（scutellaria baicalensis georgi）的干燥根中提取的一种黄酮类化合物。近年来，动物实验和临床研究均证实，黄芩苷具有抗纤维化及器官保护作用[3-5]。本课题组采用MTT法、ELISA和Western blotting等技术，研究黄芩苷对体外结肠成纤维细胞增殖影响和相关蛋白表达水平的变化，探究其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、药品及主要试剂 大鼠结肠成纤维细胞，由长春中医药大学生物化学实验室提供。黄芩苷由中国兽医药品检查所提供，批号Z0271504。地塞米松磷酸钠由中国药品生物制品检定所提供，批号2Q3W-614V。高糖DMED干粉（美国Gibco公司），胎牛血清（上海依科赛生物公司），胰蛋白酶1：250（美国GenView公司），噻唑蓝（美国GenView公司），二甲基亚砜（北京索莱宝生物公司），Rat TGF-β1（LAP）Uncoated ELISA Kit（美国 Invitrogen公司），TGF-β1 polyclonal antibody和CTGF polyclonal antibody（ 美 国Bioworld公司）。

1.2 细胞培养 大鼠结肠成纤维细胞37 ℃水浴复苏，置于含有20%胎牛血清（FBS）、1×105u / L青霉素和1×105u /L链霉素DMEM培养基种，放入37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，定时观察细胞生长情况[6]。

1.3 MTT法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期结肠成纤维细胞，0.25%胰蛋白酶消化，充分吹打成单细胞悬液，每孔200 μL接种于96孔板中。贴壁生长24 h后，分别加入含有 25、50、100、200、400、800 μmol/L 黄芩苷的培养基，以不含药培养基作空白对照（每组设7个复孔）。置于CO2恒温培养箱中分别培养24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h。吸去96孔板中液体，每孔再加入150 μL DMSO，室温震荡溶解细胞中的紫色结晶，490 nm测吸光度值，计算细胞的增殖抑制率（%）=（1-实验组吸光值/空白对照组吸光值）×100%[7-8]。

1.4 ELISA检测细胞培养基上清中TGF-β1含量 取对数生长期结肠成纤维细胞，接种于细胞培养板中，待细胞生长至70%融合状态加入不含血清DMEM培养基，培养24 h作同步化处理。将结肠成纤维细胞分为5组，空白对照组加入正常培养基，阳性对照组加入含10 mmol/L地塞米松磷酸钠培养基，中药高、中、低浓度组分别加入含30、150、750 μmol /L黄芩苷培养基。CO2恒温培养箱中培养48 h后，取细胞培养基上清液，2 000 r/min离心5 min去除细胞碎片及其他杂质。用ELISA试剂盒测定标准品及待测样品的吸光度值，根据标准曲线计算各组上清液中TGF-β1含量[9-10]。

1.5 Western blotting检测结肠成纤维细胞中TGF-β1和CTGF表达水平 1）取对数生长期结肠成纤维细胞，接种于细胞培养板中，待细胞生长至70%融合状态加入不含血清DMEM培养基，培养24 h作同步化处理。将结肠成纤维细胞分为5组，空白对照组加入正常培养基，阳性对照组加入含10 mmol/L地塞米松磷酸钠培养基，中药高、中、低浓度组分别加入含30、150、750 μmol /L黄芩苷培养基。2）弃去培养基，PBS清洗细胞2～3次， 0.25%胰蛋白酶消化并收集细胞，1 000 r/min离心5 min去除胰蛋白酶保留细胞。细胞沉淀中加入200 μL RIPA细胞裂解液涡旋混匀，冰水浴充分裂解1 h。4 ℃，12 000 r/min离心2 min去除细胞碎片及杂质，加入5×蛋白上样缓冲液100 ℃煮沸10 min，冷却后- 20 ℃保存[11]。3）使用超微量紫外-可见光分光光度计测量各组细胞中总蛋白浓度；配制SDS聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样100 μg蛋白样品，100 V恒压垂直电泳1.5～2 h；300 mA恒流转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭3 h，加入一抗4 ℃孵育过夜；TBST缓冲液清洗3次，15 min/次，加入二抗室温孵育1 h；TBST缓冲液清洗3次，15 min/次，用辣根过氧化物酶标记的显色剂显色；用凝胶成像系统分析目的条带灰度值[12-13]。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计学软件进行统计学分析。各组细胞增殖抑制率、细胞上清液中TGF-β1含量、细胞中TGF-β1和CTGF表达水平以均数±标准差（x± s）表示，组间比较采用单因素ANOVA方差分析，组间两两比较采用SNK-q法检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组结肠成纤维细胞增殖抑制率比较 见表1。

表1 各组结肠成纤维细胞增殖抑制率比较（x± s ，n = 7） %

2.2 各组结肠成纤维细胞培养基上清液中TGF-β1含量比较 见表 2。

表2 各组结肠成纤维细胞培养基上清液中TGF-β1含量比较（x± s ，n = 7） ng/mL

2.3 各组结肠成纤维细胞中TGF-β1和CTGF表达水平 灰度值分析结果显示，黄芩苷干预结肠成纤维细胞48 h后细胞中TGF-β1蛋白表达水平明显下降，黄芩苷高浓度组与阳性药组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；黄芩苷中浓度组、低浓度组与阳性药组对比，差异有统计学意义（P＜0.05）。加药干预48 h后各组结肠成纤维细胞中CTGF蛋白表达水平均有下降，黄芩苷3个浓度组、阳性药组与空白组对比，差异均有统计学意义（P＜0.01）。黄芩苷高浓度组与阳性药组对比，差异有统计学意义（P＜0.01）；黄芩苷中浓度组和低浓度组与阳性药组对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1（插页一）。

3 讨论

本研究采用MTT法检测黄芩苷对大鼠结肠成纤维细胞的增殖抑制作用，结果显示，黄芩苷抑制细胞增殖作用明显，且呈浓度依赖性。ELISA检测结果表明，黄芩苷可抑制结肠成纤维细胞胞外分泌TGF-β1，同时Western blotting结果也显示，黄芩苷能明显抑制结肠成纤维细胞中TGF-β1和CTGF的表达。

TGF-β是一类具有多种生物学活性、多重调控功能的细胞因子，其在体内分布广泛，作用明显。TGF-β不仅能调控细胞增殖，还参与细胞癌变、组织器官纤维化等病理过程。TGF-β家族有40多个成员，其中TGF-β1对纤维化具有很强的调节作用。TGF-β1是调节ECM聚集的核心因子，可刺激ECM的合成，降低ECM的降解能力[14]。研究[15]表明，TGF-β1及其受体在克罗恩病患者病变组织和肠道成纤维细胞中表达水平要高于正常肠组织。肠肌成纤维细胞根据环境变化和自身特性表达TGF-β不同亚型，当肌成纤维细胞处于炎症组织中，可表达TGF-β1和TGF-β3 2种亚型；当肌成纤维细胞处于纤维组织中则减少TGF-β3表达，增加 TGF-β1和 TGF-β2的表达量。TGF-β1可刺激肠道狭窄处成纤维细胞等间质细胞过度增殖、加强间质细胞收缩力、增强合成胶原蛋白的能力，诱导其表型发生变异。同时，肠道黏膜中TGF-β1可直接刺激黏膜层、黏膜下层及黏膜固有层的间质细胞，增加Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ等多种胶原蛋白及纤维黏连蛋白的表达。研究[16]显示，活化的TGF-β1腺病毒基因及TGF-β1基因转移至小鼠结肠，均可使TGF-β过表达，形成肠纤维化。

CTGF主要集中于肠道黏膜组织成纤维细胞中和肠道损伤组织区域内，由成纤维细胞、平滑肌细胞等间质细胞分泌合成[17]。在肠纤维化中，TGF-β主要通过Smads信号通路诱导多种细胞表达CTGF，同时CTGF蛋白又作用于这些细胞发挥TGF-β的促纤维化作用。因此，CTGF作为TGF-β的下游因子，两者相互作用对肠纤维化有重要影响[18]。

本研究结果显示，黄芩苷能抑制大鼠结肠成纤维细胞的增殖，抑制细胞分泌TGF-β1，同时下调细胞中TGF-β1和CTGF的表达，表明黄芩苷可能是通过下调细胞中TGF-β1和CTGF的表达来抑制结肠成纤维细胞的增殖，从而产生治疗肠纤维化的作用。