刘刚 丁志山 刘育辰 张永萍 万超 罗成凯

摘 要 目的：建立白及药材的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并对样品进行聚类。方法：采用HPLC法，色谱柱为Diamonsil C18，流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为270 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。以1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯为参照，绘制10批药材样品的HPLC图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）进行相似度评价，确定共有峰，并采用SPSS 23.0统计软件对其进行聚类分析。结果：10批药材样品的HPLC图谱有15个共有峰，其中9批相似度均大于0.90；经验证，10批药材样品HPLC图谱与对照指纹图谱具有较好的一致性。10批药材样品可聚为3类，S1、S2、S3、S4、S6、S8、S9、S10聚为第1类，S7聚为第2类，S5为第3类。结论：所建HPLC指纹图谱和聚类分析结果可为白及药材的质量控制提供参考。

关键词 白及；高效液相色谱法；1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯；指纹图谱；聚类分析

中图分类号 R927.2；R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）22-3050-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.06

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Bletilla striata， and conduct cluster analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of 0.1% phosphoric acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 270 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Using 1， 4-two [4-（glucose oxy） benzyl]-2-isobutyl malate as reference， HPLC chromatograms of 10 batches of medicinal samples were determined. Similarity evaluation was conducted by using Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2004 A edition）. Common peaks were determined， and cluster analysis was also conducted for it by using SPSS 23.0 statistic software. RESULTS： There were 15 common peaks in 10 batches of samples， and the similarities of 9 batches were more than 0.90. After validation， HPLC chromatograms of 10 batches of medicinal material were all in agreement with control fingerprint. The 10 batches of samples could be clustered into 3 categories. S1， S2， S3， S4， S6， S8， S9， S10 were clustered into category 1； S7 was clustered into category 2； S5 was clustered into category 3. CONCLUSIONS： Established fingerprint and the cluster analysis results can provide reference for the quality control of B. striata.

KEYWORDS Bletilla striata； HPLC； 1， 4-two [4-（glucose oxy） benzyl]-2-isobutyl malate； Fingerprint； Cluster analysis

白及為兰科植物白及[Bletilla striata （Thunb.） Reiehb. f.]的干燥块茎，其味苦、甘、涩，微寒；归肺、肝、胃经，具有收敛止血、消肿生肌之功效，临床多用于咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等症的治疗[1]。现代药理学研究表明，白及具有止血[2]、抗菌[3]、抗肿瘤[4]、抗病毒[5]等多种药理作用。白及中含有多糖类、菲类、联菲类、联菲醚类、联苄类、甾体类和三萜类等化学成分[6]，其中2-异丁基苹果酸葡萄糖氧基酯类的含量较高[7]。

2015年版《中国药典》（一部）关于白及药材的质量控制标准中仅有理化鉴别、薄层色谱鉴别及水分、灰分检查等项目[1]。目前，对白及的研究主要集中在化学成分[6]、药理作用[2-5]、含量测定[7-8]等方面。但据笔者调研所知，目前白及的野生资源十分匮乏，药材主要源自栽培，而白及药材质量受生态环境的影响很大，并且市场上存在大量伪品（如黄花白及、小白及、华白及、竹叶兰、独蒜兰和舌苞兰等），使白及药材的有效性及安全性无法得到保障[9]。仅靠一两个化学成分的含量测定，并不能有效控制白及药材整体质量，而且该药材中许多成分的对照品在国家药品标准物质目录中均查询不到，这给同时检测其中多指标成分的含量带来了一定难度。指纹图谱是医药学界公认的控制中药材质量的有效方法，具有整体性和模糊性的特点。为此，笔者收集不同产地来源的白及药材，建立其高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并对得到的数据进行处理，结合聚类分析方法进行质量评价，为其质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate-3000型HPLC仪，包括紫外检测器等[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；AR2140型万分之一电子分析天平、EX225DZH型十万分之一电子分析天平[美国奥豪斯仪器（上海）有限公司]； Q300-B型高速多功能粉碎机（上海冰都电器有限公司）；HT-220A型色谱柱柱温箱（天津市恒奥科技发展有限公司）；DRHH-2型数显恒温水浴锅（上海双捷实验设备有限公司）；SB-5200DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；8HZ-0111型循环水多用真空泵（上海予英仪器有限公司）。

1.2 试剂

1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品（成都洛玛生物科技有限公司，批号：CHB160626，纯度：98%）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

试验用白及药材均由笔者购买/采集（来源见表1），经贵阳中医学院王世清教授鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，5%B→20%B；5～25 min，20%B→35%B；25～45 min，35%B→60%B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品6.80 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加0.1%磷酸溶液-乙腈（3 ∶ 2，V/V）溶解并定容，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取药材样品适量，粉碎过3号筛，取约1.0 g，精密称定，置于100 mL具塞瓶中，加甲醇20 mL，称定质量，超声（功率：200 W，频率：40 kHz）提取30 min，取出，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S5）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以 1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，15个共有峰相对保留时间的RSD均小于2%（n=6），相对峰面积的RSD均小于5%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S5）适量，分别于室温下放置0、3、6、9、12、15、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，15个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n=7），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

2.3.3 重复性试验 精密称取药材样品（编号：S5）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，15个共有峰相对保留时间的RSD均小于1%（n=6），相对峰面积的RSD均小于5%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.4 HPLC指纹图谱的生成与相似度、共有峰相关分析

2.4.1 HPLC指纹图谱的生成 取10批藥材样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）对10批药材样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。

2.4.2 相似度分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版），以样品S1的HPLC图谱为对照，进行整体相似度评价。结果显示，10批药材样品有9批相似度均大于0.90，表明药材样品间差异较小，质量稳定性良好，详见表2。

2.4.3 共有峰的指认及相关分析 10批药材样品有15个共有峰，通过与对照品的HPLC图谱比对，指认4号峰为1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰；该峰分离良好，峰面积较大，且为所有药材样品共有，故设定为参照峰，计算其他峰相对于该峰的相对保留时间和相对峰面积及其RSD，详见表3、表4。

2.5 聚类分析

以各共有峰的相对峰面积为变量，采用SPSS 23.0统计软件，应用组间平均数联结法结合平方欧氏距离对药材样品进行聚类分析，结果见图3。结果显示，10批药材可聚为3类：第1类为S1、S2、S3、S4、S6、S8、S9、S10，大部分药材样品的相似度大于0.95；第2类为S7，该批药材样品的相似度接近0.95；第3类为S5，该批药材样品的相似度相对较低，接近0.90。

3 讨论

预试验中，笔者以色谱峰峰面积及峰数为指标，考察了不同提取时间、不同提取溶剂、加热回流提取和超声提取对结果的影响。最终确定白及药材的提取方法为20倍体积的甲醇超声提取30 min。笔者还考察了甲醇-水、0.1%磷酸溶液-甲醇、乙腈-水和0.1%磷酸溶液-乙腈4种体系作为流动相时对结果的影响。最终发现，采用0.1%磷酸溶液-乙腈为流动相时其色谱峰峰形对称性好，基线平整，能够获得较好的分离效果。

本试验通过对10批白及药材样品的指纹图谱分析可知，其共有峰的相对保留时间差异较小，但相对峰面积差异较大。但采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）对各批药材样品进行整体相似度评价的结果显示，10批白及药材样品中有9批相似度均大于0.90，说明不同来源白及药材样品在化学组成方面具有很好的相似性。

综上所述，本研究所建HPLC指纹图谱和聚类分析结果可为白及药材的质量控制提供参考。

参考文献

[ 1 ] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部[S].2015年版. 北京：中国医药科技出版社，2015：103.

[ 2 ] 董永喜，刘星星，董莉，等. 白及多糖对血热出血模型大鼠的止血作用及机制研究[J]. 中国药房，2016，27（31）：4347-4350.

[ 3 ] 俞杭苏，代斌玲，钱朝东，等. 白及须根化学成分及其体外抗菌活性研究[J]. 中药材，2016，39（3）：544-547.

[ 4 ] 仰莲. 白及茋类化学成分及其抗人肺癌细胞A549活性研究[D]. 成都：成都中医药大学，2016.

[ 5 ] 张兵，史亚，周芳美，等. 白及提取物体外抗流感病毒药效及其机制研究[J]. 中药材，2017，40（12）：2933-2938.

[ 6 ] 仰莲，彭成，李小红，等. 白及的化学成分及生物活性研究进展[J]. 中药与临床，2014，5（6）：59-64.

[ 7 ] 梅朝叶，向文英，杨武，等. UPLC-MS/MS 同时测定白及中6 个指标成分的含量[J]. 天然产物研究与开发，2016，28（8）：1233-1237.

[ 8 ] 张晓静，赵艳霞，邓雁如，等. HPLC 同时测定白及中 3 种成分的含量[J]. 中国实验方剂学杂志，2015，21（21）：40-42.

[ 9 ] 陈美君，李峰庆，吕蒙，等. 白及与其混伪品ITS2序列二级结构比较与鉴别[J]. 中国实验方剂学杂志，2017，23（15）：46-52.

（收稿日期：2018-04-21 修回日期：2018-06-18）

（编辑：张 静）