长春理工大学 国家纳米操纵与制造国际联合研究中心 程利群 曲英敏 杨焕洲 孙佰顺

导语：AFM因具有很高的空间分辨率和力学灵敏度，并可在空气、真空和溶液中检测生物细胞的表面形貌和力学特性，近年来已取得了迅速发展并获得广泛应用。本文主要介绍AFM的基本结构、工作原理以及在生命科学中应用和系统改进的一些研究进展。

1.引言

原子力显微镜（Atomic Force Microscope——AFM）于1986年由格尔德·宾尼（G．Binning）等人在扫描隧道显微镜的基础上发明的①。AFM通过检测探针针尖与样品表面之间极微弱的原子和分子间的相互作用力来检测样品的表面形貌和结构，具有很高的空间分辨率（纳米级）②。AFM不仅能够提供样品表面的三维高空间分辨图像，还能够测量探针针尖与样品原子间的极微弱的力（pN级），给出样品的力谱曲线。AFM样品不需要导电，测量环境要求低，不需要高真空，可以在常温、低温、高温、大气、溶液中使用，因此，成为生命科学研究细胞的一种有力的工具。近年来，随着AFM技术的不断发展与进步以及AFM与光学显微镜、激光共聚焦显微镜等其它技术相结合的联合使用，使得AFM的功能进一步扩展，AFM已在生命科学、化学、物理学、材料科学等领域获得广泛应用。

2.AFM的基本结构和原理

AFM主要由力检测、位置检测和信息控制处理三个部分组成③，其基本结构如图1所示。

图1 AFM的基本结构

力检测部分主要由探针架、微米尺度的微悬臂和曲率半径为纳米量级的探针组成，力检测部分是AFM的关键组成部分。

位置检测部分由步进电机、压电陶瓷、激光器和光电探测器构成，其作用是控制样品表面与探针针尖之间保持一定距离。当探针针尖与样品之间产生相互作用时，会使与针尖连接的对微弱力极敏感的微悬臂产生移动，此时，激光照射在微悬臂的背面，其反射光的位置也会因为微悬臂的移动而发生改变，这就产生了一定的偏移量，光电探测器将此偏移量记录下来并转换成电信号。

信息控制处理部分的作用，电信号通过控制器进行信号处理，控制器驱动电机进行位置调节，处理后的结果反馈给系统，驱动压电陶瓷扫描器移动，以保持样品与探针针尖一定的作用力，通过一定的成像算法即可得到样品表面形貌以及力学特性。

原子力显微镜在工作时，微悬臂的一端固定，另一端安装一个探针，探针针尖的曲率半径非常小（在纳米量级），当探针针尖与样品表面轻轻接触时，针尖尖端的原子与样品表面的原子间存在极微弱的力（机械接触力、范德华力、毛吸力、化学键、静电力等等），扫描时控制针尖与样品之间的作用力保持恒定，则微悬臂就会在垂直于样品表面的方向做上下起伏运动，利用光学检测法检测微悬臂对应于扫描各点的位置变化，则可获得样品表面的形貌和力学性能信息。由于是通过测量针尖尖端的原子与样品表面原子间的作用来进行测量的，所以原子力显微镜测定样品形貌的空间分辨率达到纳米（nm）级，而力学性能的测量精度可达到皮牛顿（pN）量级。

常用的原子力显微镜工作模式主要包括接触模式、非接触模式和轻敲模式等。接触模式工作时，探针的针尖始终与样品保持接触，针尖与样品间的作用力为库仑排斥力，其大小一般为10-8～10-11N。这种模式可以获得稳定的高分辨率图像，但针尖在样品表面上的移动以及针尖与样品间的黏附力，会对针尖造成损坏，也会使样品产生形变，进而产生虚像。非接触模式工作时，控制探针针尖与样品表面的距离保持在约5-20nm进行扫描，检测到的是探针针尖与样品表面的吸引力和静电力等，这种模式针尖不易被损坏，样品表面不易被破坏，但是由于针尖与样品之间的距离比较大，分辨率没有接触模式的高，实际上，由于针尖会被样品表面的黏附力所捕获，所以使得非接触模式的操作变得非常困难。在轻敲模式工作中，针尖与样品短时间接触，针尖和样品表面免遭破坏，轻敲模式探针针尖在接触样品表面时有较大的振幅（大于20nm），足以克服针尖与样品之间的黏附力，其作用力介于接触模式和非接触模式之间，分辨率和接触模式基本相近。目前，细胞研究中的操作模式大都采用轻敲模式。

不同接触模式的力—距离曲线如图2所示。接触模式中针尖与样品距离短，工作在斥力区，非接触模式工作中针尖与样品距离较大，工作在吸引力区。轻敲模式中探针样品间隙接触，并以一定振幅振动，探针针尖与样品的距离在一定范围内变化，针尖和样品的作用力是引力和斥力的交互作用。

图2 不同接触模式的力—距离曲线

3.AFM应用及系统研究进展

由于AFM能够在常压下甚至在液体环境下直接观测非导体样品，不需要对样品进行任何特殊处理可获得样品真实的三维表面形貌以及力学特性，适合在空气和溶剂体系中直接观测细胞甚至活体细胞的表面形貌和结构特征，因此，AFM已成为一种细胞形貌和力学特性研究的有力工具。近年来，AFM已在肿瘤细胞的研究中发挥了重要作用。肿瘤细胞是一种变异的细胞，这种变异细胞的形态和结构以及力学性能均与正常细胞不同，利用AFM可以观测研究肿瘤细胞的形态、结构和力学性质的变化，从而揭示肿瘤细胞与健康细胞的相互联系和区别，为肿瘤的诊断提供有力支撑④-⑥。此外，药物与肿瘤细胞的相互作用会使细胞的形貌和力学性能产生一定的变化，AFM用来观察研究药物对肿瘤细胞微观结构形貌和力学性质的影响，为肿瘤药物的筛选和肿瘤的治疗提供了新的途径⑦-⑨。随着AFM技术的不断发展和进步，未来将在疾病诊断和治疗以及新药研发等方面发挥越来越大的作用⑩。

原子力显微镜自问世以来，经过30余年的发展，从硬件到软件都得到了迅速发展，各生产厂商开相继开发出适于科学研究、工业和实验应用的各种不同型号的产品，以满足其在不同领域和场合应用的需求。然而，AFM目前依然还存在成像范围太小、扫描速度慢、检测结果受探针影响较大等方面的缺点。近年来，研究人员不断对AFM进行改进，如，为提高原子力显微镜的成像速度，刘璐⑾等提出了一种新的结构设计方案，Y、Z扫描器集成于测头内驱动探针进行慢轴扫描和形貌反馈，X扫描器与测头分离，驱动样品做快轴扫描。X扫描器采用高刚性的独立一维纳米位移台，能够承载尺寸和质量较大的样品高速往复运动而不易发生共振；同时Z扫描器的载荷实现最小化，固有频率得以显著提高。为了避免测头的扫描运动引起检测光束与探针相对位置的偏差，设计了一种随动式光杠杆光路；为了便于装卸探针以及精确调整激光在探针上的反射位置，设计了基于磁力的探针固定装置和相应的光路调节方案。对所搭建的AFM系统的初步测试结果表明，该系统在采用三角波驱动和简单PID控制算法的情况下，可搭载尺寸达数厘米且质量超过10g的较大样品实现13μm×13μ m范围50Hz行频的高速成像。曾俊智等⑿研究了分布式原子力显微系统，以解决由于低速成像和细胞培养时间的差异所带来的误差。把两个原子力显微镜集成到一个操作系统中，可以在一个操作界面上对两个原子力显微镜同时操作，实现对同一时刻不同细胞在相同生长环境，相同细胞在同一时刻不同生长环境、不同细胞在同一时刻同一生长环境下生长状态的分析，获取样品的效率显著提高。黄强先等⒀研制了多模态动态AFM，可以在三种反馈模式、不同阶谐振状态下对物体进行扫描测量。利用该系统在不同反馈模式、不同阶谐振状态下进行了扫描测试，结果显示，系统在各模式下具有亚纳米分辨力，其中在相位反馈模式，悬臂二阶谐振时，达到最优灵敏度与分辨力分别为17.5V/μm和0.29nm，该系统还存在频率反馈不稳定的问题，悬臂的高阶谐振特性尚需深入研究，控制算法有待于进一步完善。此外，针对AFM通常只能获得样品表面形貌和特征信息，难以获得细胞内部分子结构信息等缺点，研究人员将AFM与其他技术联合使用实现优势互补，对AFM功能进行扩展，例如，AFM与光学显微镜、激光共聚焦显微镜、全内反射荧光显微镜的组合技术，已在细胞研究中获得应用⒁-⒃。例如，AFM与激光共聚焦显微镜的组合，用于细胞表面分子的高分辨率成像，激光共聚焦显微镜对样品进行选择性的荧光标记，而AFM则提供样品的三维信息，AFM与超分辨光学显微镜组合，可以在获取细胞形貌以及力学性质的同时，还可以对细胞内部成分及结构进行定位和三维成像，大大提升了AFM在细胞物理化学特性研究中获取信息的能力。

4.总结与展望

本文对AFM的基本结构、原理和工作模式进行了较为详细的介绍，AFM通过检测探针与样品间的微弱相互作用力实现对样品表面形貌的成像和力学性能测试，其空间分辨率达纳米（nm）级，力学灵敏度达皮牛(pN)级，AFM已成为探测生物样品形貌和力学特性的有力工具，目前针对AFM系统扫描速度慢以及成像范围小等缺点进行了大量的改进工作，并与其他技术联用，取得较大进展。相信随着科学与技术的进步，AFM将在生命科学、化学、物理学、材料科学等领域获得越来越广泛的应用。

引文

①G.Bining,C.F.Quate,C.Gerber,Phys.Rev.Lett,1986,56:930-933.

②刘斌,李密,刘柱,等.电子显微学报,2017,369(6):610-623.

③王晓春,等.材料现代分析与测试技术[M].北京:国防工业出版社,2009.

④陈斌,王琦,韩立,等,肿瘤学杂志,2005,11(1):36-38.

⑤李密,刘连庆,席宁,等.科学通报,2010,55(22):2188-2196.

⑥高警蔚,韩东.影像科学与光化学,2016,34(3):233-244.

⑦C.Milburn,J Zhou,O.Bravo et al.J.of Biomedical Nanotechnology,2005,1(1):30-38．

⑧C.Rotsch,M.Radmache,Biophysical Journal,2000,78(1):520-535.

⑨A Berquand,M P Mingeot-Leclercq,YF Dufrêne,Biochimica Biophys Acta,2004,1664(2):198-205.

⑩李密,刘连庆,席宁,等.科学通报,2010,55(22):2188-2196.

⑾刘璐,吴森,胡晓东,等.光学精密工程,2018,26(3):662-671.

⑿曾俊智,宋正勋,曲英敏.生命科学仪器,2017,15(6):45-49.

⒀黄强先,张蕤,刘凯.光学精密工程,2017,25(2):401-407.

⒁葛林.力学进展,2018,48:461-540.

⒂秦格格,李文慧,徐家超,等.分析化学,2017,45(12):1813-1823.

⒃S Kondra,J Laishram,J Ban,et al.J.of Neuroscience Methods,2009,177(1):94-107.