苏小洁，潘显茂

（1.海口市药品不良反应监测中心，海南 海口 570311；2.海南省药物研究所，海南 海口 570311）

山楂是蔷薇科山楂属核果类植物，又叫山里果或山里红[1]。山楂的核质硬，果肉薄，味微酸涩，其果实可生吃或制作成果脯、果糕。山楂经干制后可入药，具有调节血压和血脂、增强心肌细胞和免疫系统的功能、促消化等功效[2]。研究发现，山楂中的黄酮类化合物具有较强的抗癌作用，能够抑制人体内癌细胞的生长、增殖及转移[3]。黄曲霉毒素是由黄曲霉菌株生成的次生代谢产物。该物质具有极强的毒性，可损伤人及动物肝脏的功能，严重的可引发肝癌[4-5]。因此，检测山楂干中黄曲霉毒素的含量十分必要。本次研究主要探讨用免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱荧光法检测山楂干中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2含量的效果。

1 仪器与试剂

本次实验使用的仪器是岛津LC-20AT二元梯度高效液相色谱仪(包括SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、CBM-20A系统控制器、RF-20A荧光检测器)、CRV-6A岛津化学反应单元系统、AUW220D岛津电子天平、美国维康VICAM AflaTest黄曲霉毒素分析免疫亲和柱。本次实验使用的试剂是黄曲霉毒素混合标准溶液（中国食品药品检定研究院提供，批号：610001-201301，黄曲霉毒素混合标准溶液中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的含量分别为0.04μg/ml、0.35μg/ml、1.18μg/ml、0.59μg/ml）、甲醇、乙腈、超纯水。山楂干样品购于超市，产自河北。

2 实验方法

2.1 色谱条件

本次实验的色谱柱是Agilent TC-C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 um）， 其 流 动 相 为 甲 醇 -乙 腈 -水（40:20:40），其流速为0.8 ml/min，其柱温为40℃，其荧光激发的波长为360 nm，其发射波长为450 nm，其进样量为20 ul。色谱图见图1。

图1 本次实验的色谱图

2.2 进行柱后碘衍生化的方法

本次实验使用的衍生溶液是浓度为0.05%的碘溶液（将0.5 g的碘加入到100 ml的甲醇溶液中进行溶解，对此溶解液进行稀释、定容至1000 ml），衍生化泵的流速为0.3 ml/min，进行碘衍生化处理的温度为70℃。

2.3 制备对照品溶液的方法

精密量取0.5 ml的混合对照溶液（包含1.04μg/ml的黄曲霉毒素B1、0.35μg/ml的黄曲霉毒素B2、1.18μg/ml的黄曲霉毒素G1和0.59μg/ml的黄曲霉毒素G2），将其置于容量为10 ml的容量瓶中，用甲醇溶液将其稀释至刻度，作为贮备溶液。精密量取1 ml的贮备溶液，将其置于容量为25 ml的容量瓶中，用甲醇将其稀释至刻度，即得对照品溶液。

2.4 制备供试品溶液的方法

精密称取15 g的山楂干供试品粉末（过二号筛），将其置于均质瓶中。在均质瓶中加入3 g的氯化钠和75 ml浓度为70%的甲醇溶液。对此混合溶液进行高速搅拌2 min，并进行5 min的离心处理。精密量取15 ml的上清液，将其置于容量为50 ml的容量瓶中，对其进行定容，并摇匀。用孔径为0.45μm的微孔滤膜对混合溶液进行滤过处理。取20.0 ml的续滤液，以3 ml／min的流速通过免疫亲和柱，用20 ml的超纯水进行洗脱处理，弃去洗脱液。在剩余的溶液中持续打入空气，将其中的超纯水挤出免疫亲和柱，再用少量的甲醇溶液对其进行洗脱。收集洗脱液，将其置于容量为2 ml的容量瓶中，用甲醇溶液将其稀释至刻度，并摇匀，即得供试品溶液。

3 结果

3.1 进行线性关系实验的结果

分别精密量取 5μl、10μl、15μl、20μl、25μl的混合对照品溶液，将这些混合对照品溶液注入到液相色谱仪中，测定峰面积。以峰面积（X）作为横坐标，以进样量（Y，ng）作为纵坐标，绘制标准曲线。得到黄曲霉毒素的线性回归方程。黄曲霉毒素的线性回归方程是：黄曲霉毒素B1:Y =0.0006X-0.3344（R2=0.9998），其线性范围为0.6～50 pg；黄曲霉毒素B2:Y =0.0004X+0.0898（R2=0.9996），其线性范围为0.1～15 pg；黄曲霉毒素G1:Y=0.0006X+0.1159（R2=1），其线性范围为0.7～50 pg；黄曲霉毒素G2:Y=0.0006X-0.156（R2=0.9997），其线性范围为0.2～15 pg。

3.2 进行精密度实验的结果

精密量取20μl的混合对照品溶液，连续进样6次。结果显示，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的峰面积RSD分别为0.7%、1.0%、0.8%、0.6%，表明本法的精密度良好。

3.3 进行稳定性实验的结果

按照2.4中的方法制备供试品溶液。在供试品溶液中加入1.0 ml的混合对照品溶液。在2.1的色谱条件下，分别在第0 h、第2 h、第4 h、第16 h、第24 h时进样。结果显示，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的峰面积RSD分别为1.2%、0.7%、0.9%、0.4%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

3.4 进行重复性实验的结果

按照2.4中的方法制备6份供试品溶液。在这6份供试品溶液中分别加入1.0 ml的混合对照品溶液。结果显示，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的峰面积RSD分别为1.2%、1.7%、1.8%、2.0%，表明本法的重复性良好。

3.5 进行检测限实验的结果

按照比例稀释混合对照品溶液。当信噪比为3：1时，将注入仪器中混合对照品溶液的量确定为检测限。测得黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的检测限分别为0.2 pg、0.04 pg、0.2 pg、0.07 pg。

3.6 进行加样回收率实验的结果

称取同一批次的6份阴性样品粉末，每份阴性样品粉末的重量为15 g。在这些阴性样品粉末中分别加入0.5 ml的对照品贮备液，按照2.4中的方法制备供试品溶液。进样测定并计算供试品溶液的加样回收率。测得黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的平均回收率分别为89.9%、86.2%、84.1%、79.4%。

3.7 进行样品含量测定的结果

取5 批样品，每批样品各15 g，按照2.4中的方法制备。进样测定并计算供试品溶液中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的含量。结果见表1。

表1 进行样品含量测定的结果（μg/kg）

4 讨论

本次实验的结果显示，在这5批山楂干样品中，有1批山楂干样品被检出含有黄曲霉毒素B1。这批山楂干样品中黄曲霉毒素B1的含量虽然未达到《药典》中对黄曲霉毒素的限量（每1000 g药材中含有黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G 1、黄曲霉毒素G2的总量不得超过10μg），但它提示我们，山楂干样品有被黄曲霉毒素污染的可能。因此检测山楂干中黄曲霉毒素含量十分必要。

综上所述，免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱荧光法简便、准确、重复性好,可用于测定山楂黄曲霉毒素的含量。