【作 者】柯林楠，汤京龙，宋茂谦，高敏，陆云龙，赵帅旗，闭静秀，何利中，母瑞红

1 中国食品药品检定研究院(医疗器械标准管理中心，CFDA)，北京市，102629 2 江阴贝瑞森生化技术有限公司，江阴市，214437

0 引言

贻贝粘蛋白（Mussel Adhesive Protein，MAP）是从紫贻贝（Mytilusedulis）的足丝腺中提取纯化的一种蛋白质。由于MAP具有优良的粘附特性、生物相容性及生物可降解性[1-2]，其在医疗领域具有广泛的应用前景，可作为生物粘合剂，用于修复断裂骨骼、皮肤创伤等[3-5]。MAP中含有大量的3, 4-二羟基苯丙氨酸 （即多巴Dopa）。Dopa是一类邻羟基酚类衍生物，特殊的结构使得它呈现出多样的化学反应性，可以通过非共价健和共价键与多种基材表面键合，形成很强的粘附力[6-9]。同时研究者还发现Dopa的氧化还原态对MAP粘附性能也有很大影响，还原态的多巴与无机表面有很强的键合力。设计原位固化材料和粘附生物底物时需要氧化态的多巴醌[10]。因此，Dopa氧化还原状态的研究对于MAP粘合剂在临床上成功应用，以及产品的质量控制都是非常必要的。本文对MAP的氧化还原态进行了研究，探讨HPLC法对MAP的氧化还原态表征的可行性。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

高效液相色谱仪，岛津LC-15C；紫外分光光度仪，岛津UV-2401PC；ACO-001电磁式空气泵，森森集团股份有限公司。

1.2 试剂

1 mmol/L DOPA标准溶液配制：精密称取L-DOPA标准品197.2 mg，至1 L容量瓶中，加1 mL浓盐酸溶解，加蒸馏水定容至1 L。

考马斯亮蓝G-250试剂：取0.1 g考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL质量浓度为0.85 g/mL的磷酸，作为母液保存，使用时用水稀释到1 000 mL。

酸试剂：取4.3 mL浓盐酸，加95.7 mL蒸馏水，摇匀。

碱试剂： 取4 g氢氧化钠，加蒸馏水溶解，并稀释至100 mL。

亚硝酸试剂：1.45 mol/L 亚硝酸钠溶液和0.41 mol/L 钼酸钠溶液；取亚硝酸钠10 g与钼酸钠10 g，加水稀释至100 mL。

2 样品制备

2.1 不同年份生产的样品留样

分别取2012年到2016年间MAP原液（江苏省江阴贝瑞森生化技术有限公司），在洁净工作台上用含有0.005%乙酸的生理盐水溶液将样品蛋白质含量稀释至0.5 mg/mL，作为供试液。

2.2 加速氧化试验样品

取“2.1”节中2016年的供试液，用0.1 mol/L 氢氧化钠溶液调pH至7.0，随后移取50 mL至250 mL的灭菌烧瓶中。将烧瓶置于37 ℃水浴中，用空气泵充气，气流速度为6 L/min，空气引入MAP溶液之前先通过装有水的瓶子。每24 h从烧瓶中取出5 mL作为供试液，共进行6天。

3 方法

3.1 MAP高效液相色谱(HPLC)分析

分别取“2.1”“2.2” 节中的供试液进行高效液相色谱分析。色谱条件为色谱柱：Agilent Zobax SB 300A C8（4.6×250 mm）；流动相A： 0.1%三氟乙酸水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0 min～8 min，5%～12% B；8.01 min～20 min，15% B；20.01 min～45 min，15%～100% B；进样量：20 μL；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃；流速：0.9 mL/min。

3.2 MAP中蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝法[11]测定MAP中蛋白质含量，测定波长595 nm。

3.3 MAP中多巴含量测定

MAP中多巴含量采用改良的Arnow方法测定[12]，测定波长为500 nm。

4 结果与讨论

4.1 不同年份生产的样品留样测定结果

取“2.2” 节中制备的供试液进行高效液相色谱测试，色谱图见图1。

结果表明，随着存储时间的增加，样品主峰的保留时间从30 min向29 min偏移，2016年的样品主峰保留时间为30.24 min，2012年为29.05 min。保留时间在30 min左右的主峰峰面积在变小，29 min的峰面积在增大。分析原因可能是随着存放时间，贻贝粘蛋白中的多巴基团会有部分被空气中的氧气自然氧化，还原态逐渐转变成氧化态，保留时间发生变化。

图1 不同生产时间的半成品样品的色谱图Fig.1 Chromotograms of the diあerent retained samples

4.2 加速氧化样品试验结果

表1为加速氧化样品的多巴浓度和蛋白含量测试结果。结果显示：样品中多巴浓度随着暴露时间的增长而减少，蛋白质含量基本保持恒定。

表1 暴露在空气中不同时间的样品中蛋白含量和多巴含量测试结果Tab.1 Determination of protein and dopa for samples in accelerated oxidation time

改良的Arnow方法测定多巴含量的原理如图2[12]所示。MAP中的多巴首先在酸性环境下，与亚硝酸钠反应，然后，碱试剂与多巴的两个酚羟基反应，生成红色的醌类化合物，根据显色程度测定MAP中多巴的含量，其特点是对邻苯二酚基团具有很强的特异性[13-14]。该法用于MAP中多巴含量测定时，不需要对样品水解前处理。加速氧化样品随着在空气中暴露时间的增长，多巴逐渐氧化成多巴醌，无法参与图2所示的反应，多巴含量下降。

图2 多巴比色法检测原理Fig.2 Schematic representation of colorimetric method for Dopa

图3 为加速氧化样品的色谱图，结果表明样品加速氧化的时间越长，主峰保留时间偏移越明显。与图1结果基本一致。结合比色法测定多巴含量的结果可以看出，MAP色谱峰保留时间的偏移与多巴的氧化-还原态有关。

图3 加速氧化样品的色谱图Fig.3 Chromotogram of samples in accelerated oxidation

5 结论

贻贝粘蛋白中的多巴基团对于其功能的实现至关重要，多巴及其氧化产物对于贻贝粘蛋白的粘附、交联成膜以及促愈合功能的实现是不可或缺的。因此，贻贝粘蛋白氧化还原状态评价是MAP质量控制的关键性步骤，MAP氧化还原状态的量化表征也是至关重要的。本文首次采用HPLC法对MAP氧化还原状态进行了研究，结合比色测定多巴含量的结果后发现MAP色谱峰的保留时间变化与MAP氧化还原状态存在相关性，可以通过特征吸收峰的变化鉴别贻贝粘蛋白的氧化还原状态。实验结果对于贻贝粘蛋白医疗产品开发、产品改性以及产品的质量控制提供方法有重要的指导意义。