钟永军，何昕蔚，余达勇，蒋晶晶，江景勇

(1.中国科学院宁波材料技术与工程研究所 功能材料与纳米器件事业部，浙江 宁波 315201；2.台州学院 生命科学学院，浙江 台州 318000； 3.台州市农业科学研究院，浙江 临海 317000)

近年来，台州猕猴桃尤其是红阳猕猴桃的种植面积迅速扩大，但在种植过程中细菌性溃疡病频发，给台州猕猴桃产业的健康发展带来了挑战。猕猴桃细菌性溃疡病是一种由丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidae，Psa)引起的毁灭性病害[1-2]。由于地理环境、气候、猕猴桃品种等因素的不同，各地发现的猕猴桃溃疡病病原菌在基因型、致病能力和流行性等方面具有一定的独特性[3-4]。根据遗传差异和毒素的产生能力，Psa可分为4种生物型(biovar)，分别为biovar 1、2、3、5[5]。其中，biovar 1于1984年在日本发现，并在随后1992年意大利暴发的猕猴桃溃疡病害中被检测到，能产生菜豆丁香假单胞菌毒(phaseolotoxin)；biovar 2仅在韩国发现，能产生冠菌素(coronatine)；biovar 3近年来在全球普遍流行，没有检测出毒素基因；biovar 5最早于2012年在日本发现，目前在日本的局部地区流行[6-7]。然而，国内各地对猕猴桃种植区Psa病菌的生物型分型的报道还比较少。

化学药物防治是当前国内外猕猴桃种植中的主要防治手段之一。在欧洲，含铜制剂被大量用于防治猕猴桃细菌性溃疡病；而在亚洲，链霉素也是主要的防治药物。由于链霉素和含铜制剂的长期使用，日本、韩国等国的Psa病原菌出现了对链霉素和铜制剂的耐药性，限制了链霉素和铜制剂的防治效果[8-10]。此外，由于地理环境、气候、猕猴桃品种等因素的差异，各地流行的病原菌在基因型、致病能力、传染性和药物敏感性等方面不尽相同，使得简单套用其他地区的防治方法未能达到理想的效果。

筛选新型的防治药剂是当前国内外猕猴桃溃疡病防治中的一个重要课题。无机纳米抗菌剂具有抗菌广谱性、化学稳定性、缓释性及环境友好等特点，越来越为人们所关注。纳米氧化锌(ZnO)是尺寸在1～100 nm的无机纳米材料，因其价格低廉、无需紫外照射就能表现出良好的抗菌效能、不易产生耐药性等优点，是当前研究较为活跃的绿色抗菌剂之一[11-13]。关于纳米ZnO抗菌性能的产生机制主要有3个假说，即光催化抗菌机制、金属离子溶出抗菌机制和活性氧抗菌机制[12]。目前，纳米ZnO的应用研究主要集中在生命医学领域，在农业病原菌防治应用方面的相关研究还比较少。本研究从台州当地主要猕猴桃果园染病枝条中分离病原菌，并对其进行分子鉴定，旨在掌握本地猕猴桃溃疡病病原菌的特征。同时，对分离的病原菌进行防治药物筛选，指导农业生产用药。

1 材料与方法

1.1 材料

2016年6月至2017年4月，于台州街头的红阳猕猴桃种植园，采集被溃疡病感染的枝条和树皮。供试菌株为丁香假单胞菌番茄变种DC3000(由台州学院张慧娟老师惠赠)，以及陕西分离的丁香假单胞猕猴桃致病变种(由台州市农业科学研究院惠赠)。营养肉汤(NB)培养基：蛋白胨10.0 g·L-1，牛肉浸出粉3.0 g·L-1，氯化钠5.0 g·L-1，pH 7.2；若配置营养琼脂培养基(NA)，加入琼脂15.0 g·L-1。供试农用杀菌剂使用时根据其说明书中推荐的最低倍数稀释。

纳米氧化锌(直径50 nm)购自阿拉丁。其他试剂均购自国药集团或上海生工。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离

取新鲜的染病枝条，洗净后切成小块，无菌水淋洗3遍后用70%乙醇浸泡消毒1～2 min。取出后用无菌水淋洗3遍，再将样品放入10%的H2O2溶液10 min。取出后再用无菌水淋洗3遍，切除样品边缘接触杀菌剂的部分，将剩余的样品碾碎后放入无菌水中剧烈振摇混匀。最后将上述充分混匀后的样品做连续梯度稀释，从每个稀释梯度取100 μL涂布于NA平板，倒置于26 ℃培养箱培养。48 h后，挑取单菌落进行纯化培养。

1.2.2 病原菌分子鉴定

分离得到的菌株先通过特异引物PSA-F/R确认是否为Psa阳性，再使用细菌16S rRNA通用引物27F/1525R扩增，最后用biovar分型引物检测Psa病原菌的生物型。引物信息如表1所示。得到的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测后都送往上海生工测序。

1.2.3 病原菌接种感染

病原菌接种感染采用创伤接种法[18]。将2 mL新鲜培养的菌液(D600=1.2)离心，弃上清，用100 μL 0.9%氯化钠溶液重悬，取2 μL重悬后的菌液滴加于猕猴桃嫩叶背面叶脉处，然后使用无菌注射器刺穿叶脉，使菌液直接接触嫩叶伤口。0.9%无菌氯化钠溶液作为对照。接种后，将整株植物放置于18 ℃光照培养箱，其中100%光照强度10 h，33%光照强度4 h，无光照10 h，每天观察记录。

表1引物序列

Table1Primer sequences

引物名称Primer name特异性Specificity引物序列 (5′-3′)Primer sequences (5′-3′)产物大小Product size/bp参考文献ReferencePSA-FPSA-Rpv. actinidiaeCAGAGGCGCTAACGAGGAAACGAGCATACATCAACAGGTCA311Balestra等[14]PsaJ-FPsaJ-Rbiovar 1GACGTCGACGACAAGGTGATAGTAAACCGTGCCGTCATCTC481Lee等[15]PsaK-FPsaK-Rbiovar 2GACAAAGCCAAAAAGGCGATGCCAAGCCCAAGTATCCAAGC413Lee等[15]hopH1-FhopH1-Rbiovar 3CATCTCGATATCCAGGCATCTTCAGCTCGGATGGAGTTCT605Ferrante等[16]hopZ5-F2hopZ5-R2biovar 3CAGGAATTCATGACTTCTCATAGTCTCGAAGATTCAATGG630Sawada等[7]Con044FCon044Rbiovar 5AAGCGCCTTAATCTCGTTCAATTCCGGATTGGGTATCACA470Fujikawa等[6]27F16S rRNAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG1535Lane[17]1525RAAAGGAGGTGATCCAGCC

1.2.4 药敏试验

农用杀菌剂药敏试验采用预加菌液倾注平板法和打孔抑菌圈法[19]。向15 mL无菌离心管中加入50 ℃的NA培养基，将100 μL新鲜培养菌液加入其中并摇匀，再迅速倒入培养皿中静置10 min，用6 mm圆形打孔器在每个平板上打3个孔，孔与孔之间的距离不小于2 cm，向每个孔中加药30 μL，平放于26 ℃培养箱中培养24～48 h。用游标卡尺测量抑菌圈大小。重复3次，结果表示为平均值±标准差。

1.2.5 纳米氧化锌MIC测定

纳米氧化锌最小抑菌浓度(MIC)的测定参考Padmavathy等[20]的方法。将灭菌后的纳米氧化锌加入无菌去离子水中，超声波处理10 min，使溶液形成稳定的悬浊液，再用2倍稀释法对纳米氧化锌溶液作梯度稀释。向1.8 mL的NB培养基中加入100 μL的纳米氧化锌稀释溶液和100 μL的菌液，使最终菌液浓度控制在5×105cfu·mL-1左右，纳米氧化锌浓度为200、100、50、25、12.5 μg·mL-1。混匀后置于26 ℃摇床培养24 h，加入40 μL的2 mol·L-1盐酸溶解氧化锌颗粒，肉眼观察培养基不混浊的最低纳米氧化锌浓度，即是其MIC值。

1.2.6 时间-杀菌曲线的测定

向1.8 mL的NB培养基中加入100 μL的纳米氧化锌稀释溶液和100 μL的菌液，使最终菌液浓度控制在5×105cfu·mL-1左右，纳米氧化锌浓度为200、100、50、25 μg·mL-1。混匀后置于26 ℃摇床培养。在培养的1、2、4 h取样，涂平板计菌落数。以培养时间为横坐标，活菌数的自然对数值为纵坐标，绘制杀菌曲线[21]。重复3次，结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离鉴定

用引物PSA-F/R对分离的疑似病原菌进行PCR扩增，能扩增出长度约为300 bp特异条带的菌株为Psa阳性(如图1-A中JT1、JT2、JT4、JT5、JT6和JT7)。用16S rRNA通用引物27F/1525R对Psa阳性菌株进行PCR扩增并送测序，测序结果表明，所分离菌株都为Psa阳性菌株。将测序结果上传GenBank，登录号分别为MF950900、MF950901、MF950902、MF950903、MF950904和MF950905。

分别利用biovar 1特异引物(PsaJ-F/PsaJ-R)、biovar 2特异引物(PsaK-F/PsaK-R)、biovar 3特异引物(hopZ5-F2/hopZ5-R2和hopH1-F/hopH1-R)和biovar 5特异引物(Con044F/Con044R)对Psa阳性菌株进行PCR扩增。结果显示，只有biovar 3特异引物能扩增出目的条带(如图1-B、C)，表明这些Psa菌株都是biovar 3型。

2.2 回接感染试验

将分离的Psa病原菌株回接感染盆栽猕猴桃叶片。典型的结果如图2所示，病原菌株接种感染后，叶片接种病原菌处出现直径为1～2 mm棕黑色斑点(图2“*”标记处)，叶缘出现棕色纹路和斑块(图2 Psa病原菌接种“△”标记处)，表明所分离的Psa菌株具有致病性。

2.3 农用杀菌剂的药敏分析

对23种农用杀菌剂进行药敏试验，结果发现，不同农用杀菌剂的抑菌效果差异很大。其中，12种农用杀菌剂对台州分离的病原菌株都有抑菌作用(可见明显的抑菌圈)；而另外11种农用杀菌剂对病原菌都没有抑菌作用(表2)。根据抑菌圈的大小，病原菌对四环素、乙蒜素和丁子香酚敏感(抑菌圈直径≥15 mm)，对辛菌胺醋酸盐、嗅菌·咪鲜胺、中生菌素、中生·寡糖素较为敏感(抑菌圈直径介于10～15 mm)。

A，引物PSA-F/R的PCR产物电泳结果； B、C，biovar 3检测，其中B为引物hopZ5-F2/hopZ5-R2的PCR产物电泳结果，C为引物hopH1-F/hopH1-R的PCR产物电泳结果。M，DNA marker；JT1、JT2、JT4、JT5、JT6、JT7为本研究分离的Psa阳性菌株编号；P，阳性菌株；DC3000(丁香假单胞菌番茄变种)，阴性对照。A， Electrophoresis analysis of PCR product by primer PSA-F/R; B， Electrophoresis analysis of PCR product by primer hopZ5-F2/hopZ5-R2; C， Electrophoresis analysis of PCR product by primer hopH1-F/hopH1-R; M， DNA marker; JT1， JT2， JT4， JT5， JT6， JT7， Isolated Psa strain numbers; P， Positive control; DC3000， Negative control.图1 PCR扩增电泳图Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product

“*”标记为接种Psa病原菌株；“↑”标记为阴性对照刺破点。“*”， Inoculate Psa strain; “↑”， Negative control.图2 Psa病原菌接种感染猕猴桃叶片Fig.2 Kiwifruit leaves inoculated with Psa strain

2.4 纳米氧化锌的抑菌研究

纳米氧化锌的MIC检测结果表明，纳米氧化锌对台州分离的Psa病原菌的MIC值为50 μg·mL-1(图3-A)。将0、25、50、100和200 μg·mL-1纳米氧化锌与Psa病原菌进行混合孵育，在不同时间点取样并记录活菌数。结果表明，纳米氧化锌的杀菌能力随着纳米氧化锌浓度和作用时间的增加而增强(图3-B)。

3 讨论

红阳品种猕猴桃是较易感染猕猴桃溃疡病的品种[22]，目前国内关于该品种Psa病原菌的biovar分型鉴定的相关报道还不多。本研究从台州的红阳猕猴桃发病果园分离到Psa病原菌，分子鉴定结果表明该Psa病原菌属于biovar 3型。这与胡月等[23]最近报道的四川多地猕猴桃溃疡病菌为biovar 3型结果一致。

本研究对23种农用杀菌剂进行了筛选，结果显示四环素和乙蒜素对本研究分离的Psa病原菌抑菌效果较好。这与阳廷密等[24]报道的结果一致，他们发现乙蒜素和四环素对猕猴桃叶片溃疡病的防治效果较好。链霉素和铜制剂是目前国内防治猕猴桃溃疡病普遍使用的药剂，如秦虎强等[25]用田间全树喷雾和树干涂药试验方法发现，农用链霉素和氢氧化铜预防效果较好(超过60%)。值得注意的是，李春游等[26]对2010—2013年分离自陕西省关中地区的102株Psa病菌进行链霉素抗药性监测，结果发现15.7%的Psa菌株MIC≥45 μg·mL-1，且分离自红阳猕猴桃品种的Psa菌株对链霉素的MIC值明显高于分离自秦美品种的Psa菌株。在本研究中，Psa菌株对农用硫酸链霉素、氢氧化铜及多种铜制剂并不敏感(表2)。这些差异是否是本研究采用打孔抑菌圈法、Psa病菌差异、不同农药厂家药剂差异等引起，有待进一步探究。此外，本研究发现纳米氧化锌对Psa菌株的MIC值为50 μg·mL-1，且杀菌效果具有浓度和作用时间依赖性，显示了纳米氧化锌在猕猴桃溃疡病防治上的潜在应用价值。接下来，有必要对本研究中有抑菌效果的药物开展田间试验，以进一步明确这些药物在田间的防治效果。

表2农用杀菌剂及抑菌圈直径

Table2Farm fungicides and the diameter of inhibitory rings

杀菌剂名称Fungicide name生产公司Company稀释倍数Dilution抑菌圈直径Inhibitory ring/mm四环素Tetracycline辽宁微科生物工程有限公司Liaoning Wkioc Bioengineering Co., Ltd.100020.33±2.08乙蒜素Ethylicin河南中威高科技化工有限公司Henan Zhongwei High-tech Chemical Co., Ltd.40018.33±5.13丁子香酚Eugenol河南神润生物科技有限公司Henan Shenrun Biological Technology Co., Ltd.25015.33±0.58辛菌胺醋酸盐Xinjunan acetate西安近代农药科技股份有限公司Xian Modern Pesticide Co., Ltd.20012.33±1.15嗅菌·咪鲜胺Bromothalonil·Prochloraz陕西康禾立丰生物科技药业有限公司Shanxi Konho Biological Technology Co., Ltd.50011.67±2.89中生菌素Zhongshengmycin江西正邦生物化工有限公司Jiangxi Zhengbang Bio-chemical Co., Ltd.75011.00±1.00中生·寡糖素Zhongshengmycin·Oligosaccharin江苏明德立达作物科技有限公司Jiangsu Mindleader Corp Science Co, Ltd.160010.00±0.01琥胶肥酸铜Copper(succinate+glutarate+adipate)齐齐哈尔四友化工有限公司Qiqihaer Siyou Chemical Co, Ltd.1009.00±0.01多抗霉素polyoxin山东聊成赛德农药有限公司Shandong Liaocheng Saide Pesticide Co, Ltd10009.00±1.00腐必清Fubiqing河南神润生物科技有限公司Henan Shenrun Biological Technology Co., Ltd.3008.33±0.58腐皮消Fupixiao郑州劳恩格润生物科技有限公司Zhengzhou Laoengerun Biological Technology Co., Ltd.5007.33±0.58氯溴异氰尿酸Chloroisobromine cyanuric acid河南银田精细化工有限公司Henan Yintian Fine Chemical Co., Ltd.3507.00±0.00吗胍·乙酸铜Moroxydine·Copper(II) acetate山东鑫星农药有限公司Shandong Xinxing Pesticide Co., Ltd.130—氢氧化铜Copper hydroxide上海杜邦农化有限公司Shanghai Dupont Agricultural Chemical Co., Ltd.750—百菌清Chlorothalonil利民化工有限公司Limin Chemical Co., Ltd.1000—叶枯唑Bismerthiazol一帆生物科技集团有限公司Yifan Biotechnology Group Co. Ltd.300—氧化亚铜Copper(I) oxide北京十方技术有限责任公司Beijing Sofine Technology Co. Ltd.1000—农用硫酸链霉素Streptomycin sulfate重庆丰化科技有限公司Chongqing Fenghua Technology Co. Ltd.1000—农用新植霉素New mycophencin青岛田园科技有限公司Qingdao Tianyuan Technology Co. Ltd.1000—啶酰菌胺Boscalid巴斯夫(中国)有限公司BASF (China) Co., Ltd.1000—苯甲·多抗Difenoconazole·Polyoxin安徽绩溪农华生物科技有限公司Jixi Nonghua Biological Technology Co., Ltd.1000—松脂酸酮Abietic acid copper山东省烟台博瑞特生物科技有限公司Yantai Boruite Biological Science and Technology Co., Ltd.500—络氨铜Cupric-amminium complexion山西永和化工有限公司Shanxi Yonghe Chemical Co., Ltd.50—

“—”表示无可见抑菌圈。

“—” indicated no obvious inhibitory rings.

A，纳米氧化锌MIC测定；B，纳米氧化锌时间-杀菌曲线。A， MIC analysis of nano zinc oxide; B， Time-kill curve of nano zinc oxide.图3 纳米氧化锌抑菌分析Fig.3 Antibacterial analysis of nano zinc oxide

致谢：感谢中国科学院宁波材料技术与工程研究所的吴爱国研究员对本文涉及的纳米材料方面的指导和帮助。