张生彬，陈冰，董子龙，刘瑞，云哲琳

（内蒙古包钢医院 肝胆外科，内蒙古 包头 014010）

胰腺癌（pancreatic carcinoma）是目前已知恶性程度较高、预后较差的消化系统恶性肿瘤之一，其早期诊断困难，多数胰腺癌患者确诊时已处于中晚期[1-5]。随着外科技术的进步，胰腺癌的手术切除率有较大提高，围手术期病死率及合并症发生率也出现显著下降，但手术治疗的效果仍无显著改善，其5年生存率仍低于20%[6-9]。因此，研究新型的肿瘤标记物用于临床上早发现以及分子靶向治疗具有重大意义。人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4（human phosphatidylethanolamine-binding protein 4，hPEBP-4）是磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族的一个新成员，是一种新的抗凋亡分子，已有研究[10-14]证实其在肺癌、乳腺癌以及卵巢癌等恶性肿瘤中高表达，是一种肿瘤的致病因子。但目前国内外尚未有关于hPEBP-4在胰腺癌中的表达的报道。本研究采用实时荧光定量PCR（realtime quantitative PCR，qRT-PCR）、免疫组织化学和Western blot方法检测胰腺癌及其癌旁组织中hPEBP-4 mRNA和蛋白的表达情况，探讨hPEBP-4与胰腺癌患者临床病理参数和预后的关系，为胰腺癌的预后判断以及靶向治疗等提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集内蒙古包刚医院病理科2012年4月—2013年10月经临床和病理诊断为胰腺癌的患者30例，所有患者经手术切除病灶，收集手术切除的胰腺癌组织及其癌旁组织各30例，实验所选取的癌旁组织与胰腺癌癌灶的距离均＞2 cm。所有患者手术前均未进行放疗或化疗，且均具有完整的临床资料。本实验所有标本的获取均事先征得患者及其家属的同意，并得到医院伦理委员会的批准。

1.2 qRT-PCR检测

将保存于-80 ℃的胰腺癌组织及其癌旁组织各取100 mg左右，按照TRIzol法提取RNA，按照逆转录试剂盒（TAKARA）说明书将RNA反转录为cDNA，进行qPCR扩增以检测胰腺癌组织及其癌旁组织中hPEBP-4 mRNA的表达。hPEBP-4-F：5'-GGG TTG GAC AAT GAG GCT G-3'，hPEBP-4-R：5'-TGT GCT TGG GCT CGC TGG C-3'；β-actin-F：5'-GAT CAT TGC TCC TCC TGA-3'，β-actin-R：5'-ACT CCT GCT TGC TGA TCC AC-3'。其扩增体系为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共39个循环；72 ℃延伸1 min。采用2-△△CT进行数据分析。

1.3 Western blot

将保存于-80 ℃的胰腺癌组织及其癌旁组织各取100 mg左右提取组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每孔加入20 μL蛋白样品，12%的SDS-PAGE凝胶电泳后，转印至硝酸纤维素膜（PVDF）上，采用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入山羊抗人多克隆hPEBP-4一抗（Abcam，a b 9 9 4 6 8，稀释比1:5 0 0）后4 ℃孵育过夜，经TBST洗涤3次后，加入特异性驴抗山羊二抗（Abcam，ab205723，稀释比1:2 000），室温孵育1 h后洗膜，显影拍照。

1.4 免疫组化

胰腺癌组织及其癌旁组织芯片进行免疫组化检测hPEBP-4蛋白的表达，其具体步骤如下：切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，置于3%过氧化氢溶液中进行室温孵育15 min以去除内源性过氧化酶，pH=6.0的柠檬酸溶液中煮沸后冷却至室温，用PBS溶液浸洗3次。血清室温封闭30 min后滴加hPEBP-4（1:50）一抗，37 ℃温箱孵育1 h，加二抗，室温孵育30 min，DAB显色，镜下观察至显色合适为止，苏木精复染，自来水冲洗返蓝后梯度酒精脱水，二甲苯透明，固定封片后拍照观察。

1.5 免疫组化结果判定

hPEBP-4定位于细胞膜和细胞浆，其阳性染色呈棕黄色。每个切片在高倍镜下随机选取5个不同的视野，观察细胞染色强度及计数阳性染色细胞数所占细胞总数的百分比，评分标准如下：⑴ 按细胞染色强度记分：无染色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。⑵ 按阳性细胞所占百分比记分：阳性细胞数≤1%记为0分，1%～10%记为1分，11%～50%记为2分，51%～100%记为3分。最后将两项得分相乘的分值为标准：总分0～3分为低表达，4～9分为高表达。

1.6 统计学处理

采用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计学分析。临床病理参数与hPEBP-4表达的相关性采用χ2检验，采用Kaplan-Meier法进行生存分析，采用Log-rank检验比较不同的生存曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胰腺癌组织及其癌旁组织中hPEBP-4 mRNA的表达

采用qRT-PCR对30对胰腺癌组织及其癌旁组织中hPEBP-4 mRNA表达水平进行检测，其结果显示，与癌旁组织比较，胰腺癌组织中hPEBP-4 mRNA表达上调者24例（24/30，80.0%），下调者6例（6/30，20.0%）（图1）。

2.2 胰腺癌组织及其癌旁组织中hPEBP-4蛋白的表达

为了进一步验证hPEBP-4在胰腺癌组织及其癌旁组织中的表达情况，采用Western blot和免疫组化检测其蛋白表达。Western blot结果与qRTPCR结果一致，即与癌旁组织比较，胰腺癌组织中hPEBP-4 mRNA表达上调者24例（24/30，80.0%），下调者6例（6/30，20.0%）；免疫组化结果显示，胰腺癌组织中hPEBP-4 mRNA表达者24例（24/30，80.0%），低表达者6例（6/30，20.0%），而癌旁组织hPEBP-4 mRNA高表达5例（5/30，16.7%），低表达者25例（25/30，83.3%），差异有统计学意义（χ2=24.093，P＜0.001）（图2）。

图1 qRT-PCR检测30对胰腺癌组织及其癌旁组织中hPEBP-4 mRNA的表达Figure 1 The mRNA expressions of hPEBP-4 in the 30 paired pancreatic cancer tissue and adjacent tissue detected by qRT-PCR

图2 hPEBP-4蛋白表达水平的检测 A：其中8例样本Western blot检测结果；B：其中2例样本的免疫组化检测结果（×400）Figure 2 Measurement of hPEBP-4 protein expression A:Western blot results from 8 cases; B: Immunohistochemical staining results from 2 cases (×400)

2.3 hPEBP-4与胰腺癌患者临床病理参数的关系

分析hPEBP-4的表达水平与胰腺癌患者临床病理参数之间的关系，结果表明，hPEBP-4的表达水平与胰腺癌患者的肿瘤分化程度以及TNM分期有关（P＜0.05），但是与患者的性别、年龄、血管浸润、肿瘤位置、淋巴结转移以及神经浸润无关（均P＞0.05）（表1）。对血清CA19-9和CEA进行统计，以CA19-9＞37 U/mL，CEA＞5 ng/mL为异常高表达水平标准。CA19-9异常高表达与hPEBP-4的表达水平有关（P＜0.05），但CEA异常高表达与hPEBP-4的表达水平无关（P＞0.05）。

表1 hPEBP-4表达与胰腺癌患者临床病理参数的关系[n（%）]Table 1 The relationship between hPEBP-4 expression and clinicopathological variables of pancreatic cancer patients[n (%)]

2.4 hPEBP-4与分化程度、TNM分期、血清CA19-9的关系

胰腺癌分化程度与hPEBP-4呈负相关，随着hPEBP-4表达升高，胰腺癌分化程度越低；TNM分期与hPEBP-4呈负相关，随着hPEBP-4表达升高，TNM分期越低；血清CA19-9水平与hPEBP-4呈正相关，随着hPEBP-4表达升高，血清CA19-9水平异常升高。相关性均具有统计学意义（均P＜0.05）（表2）。

表2 hPEBP-4与分化程度、TNM分期、血清CA19-9的相关性分析Table 2 Correlation analysis of hPEBP-4 with the differentiation degree,TNM stage and serum ca19-9 level

2.5 hPEBP-4与胰腺癌患者预后的关系

对30例患者进行术后随访，随访时间为15～60个月，采用Kaplan-Meier法进行生存分析，其结果显示，hPEBP-4低表达患者的总生存率明显高于hPEBP-4高表达患者，使用Log-rank进行组间生存率检验，其结果显示，hPEBP-4高表达与胰腺癌患者预后不良相关（χ2=8.658，P=0.003）（图3）。

图3 不同hPEBP-4表达水平胰腺癌患者的生存曲线Figure 3 The survival curves of pancreatic cancer patients with different hPEBP-4 expression levels

3 讨 论

胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，其恶性程度高，存活率极低，预后极差，近些年的发病率呈现逐年上升的趋势，由于其早期诊断较困难，大多数患者被确诊时病情已发展至中晚期[15-19]。胰腺癌的发生发展与多种肿瘤相关基因的过度表达以及肿瘤抑制基因的失活具有密切关系[20-22]。因此，寻求新型的肿瘤标记物用于胰腺癌患者的早期诊断、分子靶向治疗以及明确胰腺癌患者的预后具有重大意义。

hPEBP-4是磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族的一个新成员，是一种新型的抗凋亡蛋白，已有研究[10-12]证实其在肺癌、乳腺癌以及卵巢癌等恶性肿瘤中高表达，是一种肿瘤的致病因子。虞桂平等[23]（2012）的研究发现hPEBP-4阳性表达在肺鳞状细胞癌细胞中主要位于细胞浆和细胞膜，其在肺鳞状细胞癌组织中的表达显著高于其对应的癌旁组织，且hPEBP-4表达与肺鳞状细胞癌的分化程度、TNM分期以及淋巴结转移等临床病理参数显著相关（P＜0.05）。林发澄[24]发现hPEBP-4在前列腺癌组织中的阳性表达率（8 4.8 9%）显著高于其在前列腺增生组织中的阳性表达率（17.50%），且hPEBP-4的阳性表达与前列腺癌患者的分化程度、临床分期以及Gleason评分具有显著相关性，即表明hPEBP-4的表达可能影响前列腺癌的发生发展，并在一定程度上可帮助前列腺癌的诊断。临床上总结出hPEBP-4与多种肿瘤的分化、TNM分期以及转移相关，因此可以推测hPEBP-4与胰腺癌的分化、TNM分期以及转移相关，但需要临床数据进行验证此推测。而分子方面，研究[25-26]发现hPEBP-4还参与JNK信号通路的抑制，可促进Akt的激活，从而参与抑制细胞凋亡的过程。这可能是hPEBP-4参与肿瘤分化，TNM分期以及转移的相关机制之一。本研究通过qRT-PCR法分别检测30例胰腺癌组织及其配对癌旁组织中hPEBP-4 mRNA水平，与癌旁组织相比，胰腺癌组织中hPEBP-4 mRNA的表达显著上调（24/30，80%），提示hPEBP-4可能参与了胰腺癌的发生发展。随后采用Western blot与免疫组化检测hPEBP-4蛋白的表达，结果与qRT-PCR结果基本一致。在基因和蛋白水平上，hPEBP-4的表达量与胰腺癌的发生发展均有关。本研究结果显示，hPEBP-4的表达水平与胰腺癌患者的肿瘤分化程度、CA19-9以及TNM分期有关（均P＜0.05），但是与患者的性别、年龄、血管浸润、肿瘤位置、淋巴结转移、CEA以及神经浸润无关（均P＞0.05），且胰腺癌分化程度、TNM分期均与hPEBP-4呈负相关，而血清CA19-9水平与hPEBP-4呈正相关。hPEBP-4低表达患者的总生存率明显高于hPEBP-4高表达患者（P＜0.05），这一结果提示hPEBP-4高表达可能是导致胰腺癌患者预后较差的一个重要原因。

综上所述，本研究显示hPEBP-4在胰腺癌中处于高表达状态，且与胰腺癌患者的预后不良相关，其参与胰腺癌发生发展的相关机制尚不清楚，还需要大量的实验研究进行验证，然而hPEBP-4在胰腺癌中的高表达为胰腺癌的前期诊断、靶向治疗以及预后提供了新的思路。