绒山羊羔羊和成年羊前体脂肪细胞的原代培养及传代方法

2018-10-08张清月刘树林郭晓宇闫素梅

动物营养学报 2018年9期

张清月王雪刘树林于洋郭晓宇闫素梅

(内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特010018)

脂肪细胞内的脂肪酸代谢与羊肉风味密切相关。脂肪细胞是由前体脂肪细胞分化而来的，且该过程涉及一系列决定脂肪细胞形成的转录因子，所以前体脂肪细胞是研究动物脂肪代谢机理的理想模型。体外培养前体脂肪细胞，可重现脂肪细胞的发生、增殖和分化的全过程，也便于观察各种因素对细胞的影响，可用于探讨脂肪形成机理，研究对脂肪形成有效调控的方法。目前，国内利用胶原酶法已建立起牛[1]、绵羊[2]、猪[3]和绒山羊[4]等多种动物的前体脂肪细胞培养模型，但普遍来源于幼龄动物。脂肪细胞的数量在生命早期就已基本确定[5]，随着动物年龄的增长，前体脂肪细胞逐渐分化为脂肪细胞，所以利用胶原酶消化直接得到动物前体脂肪细胞只适用于胚胎和幼龄动物，这使得利用前体脂肪细胞模型进行脂肪代谢的机理研究受到了动物年龄的限制，因此，研究成年动物前体脂肪细胞的分离与培养方法是非常必要的。目前，成年动物的前体脂肪细胞主要是利用“天花板”法培养成熟脂肪细胞后再去分化获得。成熟脂肪细胞的去分化是一个以脂解为主并伴有一定水平成脂的脂质代谢过程[6]。在成熟脂肪细胞积聚的过程中，其脂肪酸代谢和脂滴代谢受基因调控最终致使脂滴消失[7]，并通过自分泌和旁分泌途径刺激脂肪细胞分解，尤其是降低脂蛋白酯酶的生成及活性，阻止前体脂肪细胞分化，诱导成熟脂肪细胞逆分化，以促成脂肪细胞的去分化[8]。但目前对于“天花板”法的研究主要集中于人[8]、鼠[9]、猪[10]、牛[11]和兔[12]等动物，而利用此法从成年绒山羊的脂肪组织中分离培养得到前体脂肪细胞的研究报道甚少。而且，传统“天花板”法使用培养瓶，需要大量的培养基，且对起始细胞接种量要求较高，尽管有研究通过将培养皿和盖玻片结合而对传统方法做出了改进，但圆形盖玻片取材困难，且在切割过程中很难避免污染，仍在一定程度上使得研究工作受阻[13]。鉴于此，本论文旨在以阿尔巴斯白绒山羊的3月龄羔羊及成年羊肾周脂肪组织为试验材料，探索绒山羊羔羊和成年羊前体脂肪细胞的培养与传代方法，并对使用培养皿的“天花板”法做出改进，为通过前体脂肪细胞深入开展绒山羊脂肪代谢机理的研究提供基础，对绒山羊脂肪代谢的调节和羊肉品质的改善具有重要的理论与实际意义。

1 材料与方法

1.1 试验动物与主要试剂仪器

试验动物：3月龄阿尔巴斯白绒山羊羔羊和阿尔巴斯白绒山羊成年母羊。

主要试剂：DMEM/F12培养基、0.25%胰蛋白酶、青链霉素双抗和胰岛素转铁蛋白硒(ITS)均购自美国Gibco公司；Ⅰ型胶原酶、地塞米松(配制1 mg/mL工作液)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，配制100 mg/mL工作液)、二甲基亚砜(DMSO)、两性霉素B(配制2.5 mg/mL工作液)和油红O均购自美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液(PBS)和胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司，其他试剂均为分析纯。

主要仪器：离心机、倒置显微镜、超净工作台、37 ℃ CO2培养箱、37 ℃恒温水浴锅、37 ℃恒温摇床、25 cm2Corning细胞培养瓶、35 mm Corning细胞培养皿。

1.2 试验方法

1.2.1 羔羊前体脂肪细胞的原代与传代培养

羔羊前体脂肪细胞的分离与原代培养：试验采用Ⅰ型胶原酶法分离获得前体脂肪细胞。采集阿尔巴斯白绒山羊羔羊肾周脂肪组织，用75%酒精浸泡30 s后立刻放入含有双抗的PBS中。超净台内用含双抗的PBS冲洗数次，剔除可见血管和结缔组织，剪成0.5～1.0 mm的脂肪小块，转移至无菌广口玻璃瓶内，加入0.1%的Ⅰ型胶原酶(V脂肪小块∶V胶原酶=1∶3)，在37 ℃恒温摇床内消化1 h，消化液经200目细胞筛过滤，滤液于250×g离心10 min。弃去所得上清液，沉淀用基础培养基(含DMEM/F12培养基15.6 g/L和碳酸氢钠1.2 g/L)制成细胞悬液，于250×g离心10 min，弃去上清液，重复上步离心步骤后，将沉淀重悬于5 mL完全培养基(含25% FBS、2.5%双抗和0.25%两性霉素B工作液)，并接种于25 cm2培养瓶内，于37 ℃、5% CO2培养，每2天换1次液。

羔羊前体脂肪细胞的传代培养：原代细胞培养至80%～90%汇合时(约第5天)，弃去培养液，PBS冲洗2次，每培养瓶加入2 mL 0.25%胰蛋白酶消化液。显微镜下观察大部分细胞回缩成圆点状并有细胞飘起时，加入3 mL完全培养基终止消化。收集细胞悬液，250×g离心10 min，弃上清，PBS冲洗后，用5 mL完全培养基重悬细胞，按1∶3的比例进行传代(即F1代)接种培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，每2天换液1次，直至细胞汇合并铺满整个培养瓶(约第7天)再传第2代(即F2代)。

1.2.2 成年羊前体脂肪细胞的原代与传代培养

成年羊前体脂肪细胞的分离与原代培养：试验采用Ⅰ型胶原酶消化法与改进后的“天花板”法分离培养得到成熟脂肪细胞后，利用去分化的方法得到前体脂肪细胞。采集阿尔巴斯白绒山羊成年羊肾周脂肪组织，用75%酒精浸泡30 s后立刻放入含有双抗的PBS中，用和羔羊脂肪组织相同的方法进行PBS冲洗、剪碎、消化、过滤和离心。离心后，取上清(脂肪细胞悬浮于上清中)，与等体积基础培养基混匀，取1 mL接种于35 mm无菌培养皿，注满完全培养基至将要溢出时，改进原有培养方法，将配套培养皿的皿盖倒置滑动地覆盖在皿上，以避免气泡产生，从而借助液体表面张力使皿盖与皿牢牢吸住，确保密闭环境。将其翻转，37 ℃、5% CO2培养，成熟脂肪细胞由于受浮力作用将漂浮到“天花板”面生长。随后每2 d换1次液，成熟脂肪细胞再次进入细胞周期，逐渐吐出胞内脂滴，7 d后基本去分化为梭形，可贴壁生长，将培养皿正立，正常培养，至脂滴完全消失且细胞去分化为具有成纤维细胞形态的前体脂肪细胞为止。

成年羊前体脂肪细胞的传代培养与前述的羔羊前体脂肪细胞传代培养相同。

1.2.3 羔羊前体脂肪细胞生长曲线的绘制

参考司徒镇强等[14]的方法，用血细胞计数板对羔羊前体脂肪细胞进行计数。取羔羊原代前体脂肪细胞，待细胞汇合度达80%时，传代并接种至35 mm培养皿，随机分为8组，每组3个重复，每2 d对每个培养皿的细胞进行计数，取平均值，至第14 d为止。按公式计算前体脂肪细胞的倍增时间:

DT=t×lg2/(lgNt-lgN0)。

式中：DT为细胞倍增时间；t为培养时间；N0为首次计数获得的细胞数；Nt为培养t时间后的细胞数。

1.2.4 羔羊和成年羊前体脂肪细胞的鉴定

将F2代前体脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞后进行油红O染色，鉴定培养得到的细胞是否为前体脂肪细胞。

羔羊及成年羊前体脂肪细胞的诱导分化：将F2代细胞培养至80%～90%汇合时，换用诱导培养基(含10% FBS、0.04%地塞米松工作液、0.011% IBMX工作液、0.5% ITS、2%双抗和0.2%两性霉素B工作液)培养2 d，再换胰岛素培养基(含10% FBS、0.5% ITS、4%双抗和0.4%两性霉素B工作液)培养2 d，最后换完全培养基继续培养，每2 d换液1次，直至80%的细胞出现脂滴。

羔羊及成年羊前体脂肪细胞的鉴定：采用油红O染色法对脂肪细胞进行分化鉴定。羔羊前体脂肪细胞及成年羊去分化得到的前体脂肪细胞经诱导成熟后，弃去完全培养基，用PBS漂洗2次。用4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗2次，油红O(1%油红O溶于异丙醇，蒸馏水稀释1.67倍)染色1 h，弃染色液，用蒸馏水漂洗数次后，于倒置显微镜下观察。

2 结果

2.1 原代培养的羔羊前体脂肪细胞形态学观察

前体脂肪细胞培养2 d时，大部分为短梭形或不规则三角形，伸展状态较明显(图1-A)。随着培养时间延长，第3、4天贴壁细胞体积更大，更加伸展，纤维状更加明显(图1-B、图1-C)。之后细胞开始迅速增殖，密度明显增大，甚至出现重叠生长，细胞发生接触抑制和密度抑制，大量汇合后生长停止，其中有的细胞出现自分化，分化的细胞开始沉积脂肪颗粒，胞内出现很多小脂滴(图1-D)。

A：原代培养第2天的细胞；B：原代培养第3天的细胞；C：原代培养第4天的细胞；D：原代培养第5天的细胞。

A： cells on day 2 of primary culture (×200); B： cells on day 3 of primary culture (×200); C： cells on day 4 of primary culture (×100); D： cells on day 5 of primary culture (×100).

图1原代培养羔羊前体脂肪细胞形态学观察

Fig.1 Morphological observation of primary cultured preadipocytes of lambs

2.2 传代培养的羔羊前体脂肪细胞形态学观察

F1代和F2代细胞与原代细胞形态特征很相似，呈纤维状。稍有不同即F1代和F2代细胞成分更均一，形态更一致，生长更旺盛，抗污染性更强，不易受杂菌污染，自分化现象减少(图2-A、图2-B)。

2.3 羔羊前体脂肪细胞生长曲线

如图3所示，羔羊前体脂肪细胞的生长曲线呈“S”型，接种4 d内细胞处于停滞期，生长缓慢，4 d后细胞生长速度加快进入对数生长期，12 d后脂肪细胞生长进入平台期，计算所得前体脂肪细胞的倍增时间为6.9 d。

2.4 羔羊前体脂肪细胞的诱导、分化及鉴定

将经过传代培养的F2代细胞进行诱导分化培养，可在镜下观察到其依次经历分化准备期、分化启动期、快速分化期和分化成熟期，最后分化为脂肪细胞。

A: F1代培养第2天的细胞；B: F2代培养4 h的细胞。

A: cells of F1 on day 2 of culture (×100); B: cells of F2 at 4 h of culture (×100).

图2传代培养羔羊前体脂肪细胞形态学观察

Fig.2 Morphological observation of passaged cultured preadipocytes of lambs

图3 羔羊前体脂肪细胞的生长曲线Fig.3 Growth curve of preadipocytes of lambs

分化准备期：将汇合度达90%的F2代细胞再培养2 d(记为分化第2天)，以使细胞从生长周期中退出，为下一步分化作好准备(图4-A)。

分化启动期：换用诱导培养液诱导2 d(记为分化第4天)，此时细胞在诱导剂的诱导下，进入分化启动期，纤维状更加明显(图4-B)。

快速分化期：再换用胰岛素分化培养液培养2 d(记为分化第6天)，细胞迅速进入分化状态，胞质内开始出现小脂滴，但数量较少。

分化成熟期：换用完全培养基继续培养2 d(记为分化第8天)，胞内脂滴更加明显，油红O染色呈阳性并能看到标志性“指环”(图4-C)。分化第10天胞内脂滴变多且体积变大，脂滴融合，占据细胞大部分体积。有些脂滴分泌到培养液中，使培养液变粘稠。部分细胞脱落，浮于培养液内。油红O染色鉴定后，脂滴被染成红色(图4-D)，说明这些细胞是脂肪细胞，分化之前的细胞为前体脂肪细胞。经过观察，从前体脂肪细胞生长为成熟的脂肪细胞约需10 d。

A: F2代分化第2天的细胞；B: F2代分化第4天的细胞；C: F2代分化第8天油红O鉴定； D: F2代分化第10天油红O鉴定。

A: cells of F2 on day 2 of differentiation (×200); B: cells of F2 on day 4 of differentiation (×200); C: cells of F2 on day 8 of differentiation, stained by oil red O (×200); D: cells of F2 on day 10 of differentiation, stained by oil red O (×100).

图4羔羊前体脂肪细胞诱导、分化及鉴定形态学观察

Fig.4 Morphological observation of inducement, differentiation and identification of preadipocytes of lambs

2.5 羔羊前体脂肪细胞胰酶消化形态学观察

不同组织或细胞对胰酶作用的反应是不一样的，且消化时间越久对细胞损伤越大。绒山羊羔羊前体脂肪细胞消化60 s时，镜下观察可见大多数细胞成圆点(图5-A)，说明细胞已被消化下来；消化90 s时细胞漂浮(图5-B)，说明消化时间略长，可能已对细胞造成损伤。因此，我们筛选出的适宜消化时间为60 s。

A:前体脂肪细胞胰酶消化60 s；B:前体脂肪细胞胰酶消化90 s。

A: preadipocytes trypsinized for 60 s (×100); B: preadipocytes trypsinized for 90 s (×100).

图5羔羊前体脂肪细胞胰酶消化形态学观察

Fig.5 Morphological observation of trypsin digestion of preadipocytes of lambs

2.6 成年羊成熟脂肪细胞的分离培养与去分化

利用胶原酶法从成年羊肾周脂肪组织上获得的脂肪细胞培养第2天时，镜下观察发现，成熟脂肪细胞漂浮到倒置培养皿的“天花板”层，贴壁生长细胞为单室脂滴成熟脂肪细胞形态，并观察到正在分裂的脂肪细胞(图6-A)；培养第5天时，细胞开始成梭型(图6-B)；随着天数的增加，梭型细胞逐渐增多，还可观察到细胞正在“吐”出脂滴(图6-C)，第14天时细胞中脂滴完全消失，去分化为具有成纤维细胞形态(图6-D)的前体脂肪细胞。

2.7 成年羊前体脂肪细胞的诱导分化与鉴定

随着F2代前体脂肪细胞的分化，被油红O染色的细胞逐渐增多(图7-A)，在分化第12 天时，90%以上的细胞油红O染色呈阳性(图7-B)，说明分化后形成的细胞是脂肪细胞，故用本法培养出的细胞为前体脂肪细胞。

3 讨论

胶原酶消化法是一种分离细胞的基本方法。胶原酶是从细菌中提取出来的，对胶原和胞间质有较好的消化作用且对细胞本身影响较小，可使细胞脱离胶原成分而不受伤害。前体脂肪细胞可来源于不同的脂肪组织，利用胶原酶消化法国内外已建立了多种动物的前体脂肪细胞培养模型，但均来源于幼龄动物。如蔡勇等[2]从1日龄绵羊的肾周脂肪组织获得前体脂肪细胞；且来源于1日龄绒山羊肌内脂肪组织[4]、60日龄猪皮下脂肪组织[3]、1日龄猪皮下脂肪组织[15]、20日龄鼠腹股沟和附睾脂肪组织[16]、新生牛腹股沟和肾周脂肪组织[1]以及7日龄猪颈部和背部皮下脂肪组织[17]的前体脂肪细胞也已通过胶原酶法获得，利用油红O染色法可将脂滴染成红色，且脂滴边界出现透明“指环”结构，该法可简便快捷地测定体外培养前体脂肪细胞的转化率，Ramirez-Zacarias等[18]报道其敏感性和准确性同前体脂肪细胞分化过程中的标志酶甘油磷酸脱氢酶相似，常用于体外前体脂肪细胞的鉴定。因此，本研究采用该方法鉴定前脂肪细胞向脂肪细胞的分化情况，结果得出，以3月龄的羔羊肾周脂肪组织为材料获得的前体脂肪细胞形态为梭形，其生长曲线呈“S”型，与成纤维细胞的生长曲线相似，经传代后(F2代)进行诱导分化，利用油红O染色发现，在分化第8天出现了标志性指环；分化第10天脂滴变大并融合，且油红O染色结果为阳性；符合由Ng等[19]和Van等[20]提出的前体脂肪细胞的鉴定标准，这说明利用此法获得绒山羊羔羊的前体脂肪细胞是可行的，这为从细胞生物学层面研究绒山羊脂肪代谢提供了重要模型。此外，本试验使用的前体脂肪细胞诱导分化剂是经典的激素鸡尾酒，由胰岛素、地塞米松和IBMX组成，国内外已有许多报道[21-22]使用该诱导剂成功诱导前体脂肪细胞分化为脂肪细胞。但有报道显示，脂肪组织中的间充质干细胞也能分化为脂肪细胞，其功能与前体脂肪细胞类似[23]，本试验所获细胞中或含有少量间充质干细胞，因此，在前体脂肪细胞的纯化以及与间充质干细胞的鉴别等方面有待开展进一步的研究。

A: 成熟脂肪细胞培养第2天；B:成熟脂肪细胞培养第5天；C:成熟脂肪细胞培养第7天；D:成熟脂肪细胞培养第14天。

A: mature adipocytes on day 2 of culture (×100); B: mature adipocytes on day 5 of culture (×100); C: mature adipocytes on day 7 of culture (×200); D: mature adipocytes on day 14 of culture (×200).

图6成年羊成熟脂肪细胞的增殖与去分化形态学观察

Fig.6 Morphological observation of proliferation and dedifferentiation of mature adipocytes of adult goats

A: 前体脂肪细胞诱导第6天油红O鉴定；B:成熟脂肪细胞培养第12天油红O鉴定。

A: preadipocytes on day 6 of inducement, stained with oil red O (×200); B: mature adipocytes on day 12 of culture, stained with oil red O (×100).

图7成年羊前体脂肪细胞诱导分化和鉴定形态学观察

Fig.7 Morphological observation of induced differentiation and identification of preadipocytes of adult goats

脂肪细胞的数量在生命早期就已基本确定[5]，随着动物年龄的增长，前体脂肪细胞逐渐分化为脂肪细胞，所以利用胶原酶法直接得到的动物前体脂肪细胞只适用于胚胎和幼龄动物，这使成年动物脂肪代谢的机理研究受到了动物年龄的限制。因此，采用成年动物的成熟脂肪细胞去分化法得到前体脂肪细胞非常必要。“天花板”法是目前最为常用的方法。成熟脂肪细胞在积聚后会自动发生去分化形成前体脂肪细胞[6]，且可通过自分泌和旁分泌途径刺激脂肪细胞分解，阻止前体脂肪细胞分化，诱导成熟的脂肪细胞逆分化，以促进脂肪细胞去分化[8]。陈晓炜等[8]用胶原酶分离30～35岁女性腹脂的成熟脂肪细胞并利用“天花板”法去分化为前体脂肪细胞；此外，源于平均年龄48.5岁的人眼眶脂肪[24]、12周龄鼠皮下脂肪[16]以及4月龄兔腹股沟脂肪[19]的成熟脂肪细胞也可通过“天花板”法去分化获得前体脂肪细胞。本试验以成年绒山羊肾周脂肪组织为试验材料，采用与羔羊相同的胶原酶消化法结合“天花板”法分离培养得到成熟脂肪细胞后，通过去分化的方法获得前体脂肪细胞，再将前体脂肪细胞进行诱导分化得到脂肪细胞。研究发现原代脂肪细胞培养2 d时开始贴“天花板”层生长，第5天时开始呈现梭形，培养14 d时完全去分化为前体脂肪细胞。在此基础上传代、诱导分化后，F2代细胞在分化第12天时90%以上的细胞油红O染色呈阳性，说明成熟的脂肪细胞已被诱导分化为前体脂肪细胞，因此采用“天花板”法获得绒山羊成年羊的前体脂肪细胞是可行的。与利用胶原酶消化法直接分离培养前体脂肪细胞相比，该法获得的前体脂肪细胞尽管也有成本相对较高、培养周期长的缺点，但其纯度高，分化能力强且不受动物年龄限制，为研究脂肪细胞的分化与代谢提供了新模型。此外，传统“天花板”法需使用培养瓶，大量耗费培养液，且对起始细胞接种量要求较高。Wei等[11]使用多个培养皿套用的方法进行培养，仍较耗费培养基。本研究在已有的脂肪细胞“天花板”培养法的基础上，将培养瓶培养改进为培养皿盖倒置培养，获得了前体脂肪细胞，不仅节约了培养基、降低了培养成本，且简便易行，保证了培养的密闭环境。