娄百勇 宋祺 曹华伟 杨永 宋伟

摘 要：目的：通过对金霉素发酵配方中各无机盐配比进行优化，筛选最有利于金霉素生产的浓度比例提高金霉素发酵效能。方法：通过利用部分因子设计方法设计出不同组合的无机盐配方进行初筛试验筛选对金霉素发酵效能有促进作用的几个无机盐配比组合，综合考虑无机盐组分和其它成分的影响，采用响应曲面优化方法进一步优化金霉素发酵无机盐配方。结果：优化后金霉素发酵基础配方中无机盐配比为氯化钠0.23%，硫酸铵0.63%，碳酸钙0.57%，硫酸镁0.025%，磷酸二氢钾0%，且单批金霉素发酵效价及正放产量较初始配方条件分别提高852μ/ml和261kg，实现增产增效的目的。同时发现不同硫酸铵浓度对菌丝形态有一定影响。结论：不同无机盐浓度对金霉素发酵有一定影响，经优化后金霉素发酵效能得到进一步提高。

关键词：无机盐浓度；金霉素；发酵；效价；正放产量

中图分类号：TQ927 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2018）27-0043-04

Abstract： Objective： to optimize the proportion of inorganic salts in chlortetracycline fermentation formula， and to select the best concentration ratio for chlortetracycline production to improve the efficiency of chlortetracycline fermentation. Methods： different combinations of inorganic salts were designed by using partial factor design method to screen out several combinations of inorganic salts which could promote the fermentation efficiency of chlortetracycline. Considering the effects of inorganic components and other components， response surface methodology was used to further optimize the formula of chlortetracycline fermentation inorganic salts. Results： the optimized basic formula of chlortetracycline fermentation was composed of sodium chloride 0.23%， ammonium sulfate 0.63%， calcium carbonate 0.57%， magnesium sulfate 0.025%， potassium dihydrogen phosphate 0%. 852 μ/ml and 261 kg. At the same time， it was found that different concentration of ammonium sulfate had some effect on the morphology of mycelium. Conclusion： different concentrations of inorganic salts have some effects on the fermentation of chlortetracycline， and the fermentation efficiency of chlortetracycline can be further improved after optimization.

Keywords： inorganic salt concentration； chlortetracycline； fermentation； potency； positive release yield

金霉素（Chlortetracycline），四環素类的一种广谱抗生素，在医疗、畜牧业和农业上有广泛的用途。在畜牧业上是用于饲料药物添加剂的八大抗生素产品之一，金霉素以其抑菌、促生长、饲料利用率高，在机体内残留量低等特点，成为目前及今后较长时间内在饲料工业中用量最大的抑菌促生长剂。

金霉素的生物合成是一项十分复杂的过程，影响其合成的因素也很多，如种子质量、原料配方、工艺条件以及发酵过程的代谢调控等。我国从上世纪50年代开始生产金霉素， 过半个多世纪的发展，目前国内生产厂家以CaCO3，MgSO4，NaCl，（NH4）2SO4，CaCl2，KH2PO4作为主要发酵基础无机盐原料，发酵周期100小时左右，效价可达到20000-25000u/mL。[1]

无机盐是微生物生长和代谢不可或缺的重要营养成分，对微生物生长代谢有重要影响，是很多代谢途径所需要的酶激活剂。来源于农作物原料的复合培养基中无机盐种类丰富，但其含量可能不能满足微生物快速生长和代谢的要求，势必影响发酵产量。在培养基成分设计和优化过程中，由于无机盐的作用不如其它营养成分突出，加之基质中存在的本底含量，常是被忽略的对象。因此，基于无机盐添加，优化金霉素发酵生产的复合培养基配方，对研究金霉素发酵高产条件有重要意义。[2]目前，关于金霉素合成的研究多是从工艺条件或代谢调控方面，有研究培养基也主要是从主要碳源玉米淀粉等着手，还没有专门针对发酵培养基中无机盐浓度配方方面的研究报道。

本实验通过利用部分因子设计方法设计出不同组合的无机盐配方进行初筛试验筛选对金霉素发酵效能有促进作用的几个无机盐配比组合，综合考虑无机盐组分和其它成分的影响，采用响应曲面优化方法进一步优化得到金霉素发酵基础培养基无机盐配方： 氯化钠0.23%，硫酸铵0.63%，碳酸钙0.57%，硫酸镁0.025%，磷酸二氢钾0%。无机盐优化后单批金霉素发酵效价及正放产量较初始配方条件分别提高852μ/ml和261kg，实现金霉素发酵生产增产增效的目的。同时发现不同硫酸铵浓度对金霉素菌丝形态有一定影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

金色链霉菌（Streptomyces aureus）， 由驻马店华中正大有限公司制备并保藏。

1.1.2 初始培養基配方

种子培养基%（kg/L）：玉米淀粉8，酵母粉2，黄豆饼粉4.8，玉米浆0.28，氯化钠0.2，硫酸铵0.48，碳酸钙0.64，硫酸镁0.048，磷酸二氢钾0.072。

发酵培养基%（kg/L）：玉米淀粉6，花生饼粉2，酵母粉0.65，黄豆饼粉1，菌体蛋白0.27，氯化钠0.2，硫酸铵0.67，碳酸钙0.6，硫酸镁0.022，淀粉酶0.007，玉米浆1.4，磷酸二氢钾0.01。

1.1.3 主要仪器及设备

8m3种子罐，温州石油化工机械厂；60m3发酵罐，温州石油化工机械厂；60m3糖罐，温州石油化工机械厂；近红外光谱分析仪（NIRS），福斯华（北京）科贸有限公司（FOSS）。

1.2 方法

1.2.1 发酵培养方法

（1）种子罐培养方法：种子罐接种后，在温度26-33℃，罐压0.040-0.060Mpa条件下培养19-25h。

（2）发酵罐培养方法：发酵培养基灭菌后，待种子罐培养结束，移入发酵罐后在温度28-34℃，菌丝长好后降温至29±3℃培养。过程中pH控制在5.9±0.5，培养压力控制在0.001-0.040MPa，同时通过补料控制合适的总糖和氨基氮，培养90-124hr后，发酵液氨基氮上升、菌丝老化、补糖量、通氨量降低时，即可正放到提炼进行处理。

1.2.2 发酵液样品分析与检测方法

培养过程中每8小时取一次样，除pH需用pH计检测外，其余各参数：总糖，氨基氮，效价均运用近红外光谱分析仪扫描检测。

1.2.3 数据统计分析工具：minitab 15.0

1.3 研究过程

1.3.1 部分因子设计进行初筛试验

利用minitab 15.0软件进行部分因子试验设计。试验设计在初始无机盐配方的基础上进行，其中初始配方见表1，因考虑到试验风险问题，对试验配方调整幅度进行控制，控制幅度见表2，最终试验设计结果如表3所示。本试验设计因子数5，水平数12，区组数1，仿行数：1，中心点：1，最终得到17次试验。

1.3.2 响应曲面优化设计

在部分因子设计所得结果基础上，进行响应曲面优化设计得出获得最优发酵效能的无机盐配方组合并进行60m3发酵罐生产验证。

2 结果与分析

2.1 部分因子设计试验初筛验证结果

对部分因子设计所得17次试验进行验证后对其放罐效价及正放产量进行统计分析得知：配方一，配方三，配方六，配方八，配方十二，配方十三，配方十五在17次试验中同时满足放罐效价，干物质CTC含量和正放产量在21000μ/ml，210g/kg及7000kg以上（结果见表4）

2.2 响应曲面优化设计

对初筛试验获得的七组配方进行第二次上罐试验验证，对所得结果利用minitab软件进行响应曲面优化设计，得到金霉素发酵过程以30m3的计料体积最优无机盐配方为氯化钠70kg，硫酸铵190kg，碳酸钙170kg，硫酸镁7.6kg，磷酸二氢钾0kg（配比为：氯化钠0.23%，硫酸铵0.63%，碳酸钙0.57%，硫酸镁0.025%，磷酸二氢钾0%），此配方预计所得放罐效价，干物质CTC含量以及正放产量分别为24651μ/ml，209g/kg，7822kg。具体见图1。

2.3 最优无机盐配方的初步验证（10批）

按照响应优化器所得最优无机盐配方进行上罐（60m3）初步验证后得知，优化后的无机盐配方所得放罐效价和正放产量较优化前分别提高532μ/ml和295kg具体见图2（a）和图2（b）。

2.4 最优无机盐配方的60m3发酵罐生产推广情况

通过初步验证结果得到优化后的配方在促进金霉素合成提高金霉素发酵效价及正放产量存在明显的优势，所以将此配方在60m3发酵罐上进行全部推广验证（总批次为36批），最终结果为放罐效价和正放产量较优化前分别提高852μ/ml和261kg，具体见图3（a）和图3（b）。且从图4可看出，试验罐批与对照罐批pH控制和过程氨基氮变化趋势以及效价增长情况差异不明显，但对照罐批前期糖耗较快，且从DO和粘度来看，对照罐批前期代谢较试验旺盛。

2.5 不同硫酸铵浓度对金霉素菌丝形态的影响

在本次试验过程中通过对菌丝形态对比发现不同的硫酸铵配比对金霉素菌丝形态有不同影响，当硫酸铵配比为0.63%时，使得菌丝17小时开始分化出现节孢子，而0.7%的硫酸铵罐批19小时并未出现明显分化现象，且试验批32小时大量开始分化，而对照批34小时开始分化出节孢子。（见图5）故硫酸铵对金霉素菌丝分化有一定影响，后续需继续研究。[3]

3 结语

本研究运用部分因子试验设计和响应曲面优化方法对金霉素发酵基础培养基中不同无机盐原料（CaCO3，MgSO4，NaCl，（NH4）2S

O4，CaCl2，KH2PO4）浓度进行优化，得到最优配比为氯化钠0.23%，硫酸铵0.63%，碳酸钙0.57%，硫酸镁0.025%，磷酸二氢钾0%，且单批金霉素发酵效价及正放产量较初始配方条件分别提高852μ/ml和261kg，实现增产增效的目地。且通过对菌丝形态进行对比发现不同硫酸铵浓度金霉素菌丝分化程度有一定的影响。

4 展望

本研究由于是在实际生产过程中进行，由于考虑到生产效能，且受生产工艺规程限定，未进行单因素跨度较大的试验来确定各个无机盐最适浓度，直接综合考虑所有无机盐浓度，且关于硫酸铵对金霉素菌丝形态的影响也未研究彻底，在今后的研究中， 将针对以上不足展开研究，选择出各个无机盐浓度的单一因素条件下的最佳配比，然后在此基础上继续进行综合验证， 同时结合菌丝形态研究找到最适的硫酸铵浓度，提高金霉素产量，降低生产成本。

参考文献：

[1]卜令军，等.不同产地玉米淀粉对金霉素发酵影响的初步研究[J].科技展望，2017，04.

[2]张由恒，等.无机盐对多杀菌素发酵产量影响[J].文章编号：1001-8689（2016）09-0658-08.

[3]王娟，等.头孢菌素C发酵过程中硫酸铵加量对菌丝形态及其效价的影响[J].求医问药下半月刊，2011，9（7）.