薛胜 李刚 李庆文 汪盛

泌尿系统肿瘤主要有输尿管肿瘤、肾肿瘤、膀胱肿瘤、尿道肿瘤，其中以膀胱肿瘤发生率最高[1]。根据全国流行病学调查结果统计[2]，膀胱癌在人体各组织恶性肿瘤中处于第9位。膀胱癌的发生病因与全身其他组织肿瘤发生相似，都是多种复杂的综合因素造成的[3]。近些年来，随着人们对肿瘤生物学微观方面的研究深入，越来越多的学者认为microRNA-100与肿瘤之间有密切的关系，并试图将microRNA芯片用于膀胱癌的诊断治疗中[4]。本文通过开展试验探讨了膀胱癌T24细胞在miR-100的作用下产生的生物学变化，报道和分析microRNA-100的相关作用机制，以便于为早期诊断以及治疗膀胱癌期提供依据，现将实验做出如下报告：

1 材料与方法

1.1 实验材料

2016年5月—2017年5月进行实验，膀胱癌T24 细胞株（中国典藏中心：CCTCC编号：GDC078）；Invitrogen公司研发的LipofeetamineTM2000；上海吉玛制药技术有限公司研发的microRNA-100，Beyotime公司研发的MTT试剂盒；Beyotime公司研发的细胞浆蛋白抽提试剂盒；Beyotime公司研究提供的抗体；mBeyotime公司研究提供的iRNA cDNA 合成试剂盒；Beyotime公司研发的miRNA 试剂盒。

1.2 实验方法

采取人工合成方式获取miR-100双链互补DNA 片段，之后将pSilencerTM 3．1-H1 neo 载体对应的表达载体插入，经过鉴定之后以此当做表达microRNA 的质粒，用LipofeetamineTM2000（脂质体2000）通过瞬时转染法将miR-100高表达质粒转染进膀胱癌T24细胞，培养24小时后选择成功转染存活率较高的细胞系继续培养。培养48小时后用Western blot 法和RTPCR技术对细胞系中survivin、VEGF的mRNA以及蛋白表达进行检测，采取四甲基偶氮唑蓝（MTT）法对24小时、36小时、48小时和60小时下膀胱癌T24 细胞增殖变化进行分析。通过Annexin V/PI双染色法通过流式细胞术对膀胱癌细胞T24凋亡状态进行检测。

1.3 统计学方法

本次研究涉及的数据均用SPSS19.0 统计软件处理研究，计量资料通过（±s）形式表示，采用t检验，P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot 实验结果

Survivin蛋白表达如图1；VEGF蛋白表达如图2。

2.2 RT-PCR实验结果

VEGF mRNA表达见图3；Survivin mRNA表达如图4。

图1 Survivin蛋白表达

图2 VEGF蛋白表达

图3 VEGF mRNA表达

图4 Survivin mRNA表达

2.3 流式细胞仪检测结果

转染miR-100后的T24细胞凋亡率较空白组和对照组增加（46.35±2.14％）,P＜0.05。细胞周期中G0/G1期细胞比率增高，见表1，2。

3 讨论

表1 各组细胞培养24 h、48 h、72 h后测定的细胞凋亡情况

根据相关资料研究显示[5-7]，肿瘤是从组织细胞DNA上出现基因突变导致的组织细胞不被约束形成的持续分裂疾病。不管是因无基因抑制能力降低还是因原癌基因活化增强引发的基因突变都会产生基因的异常表达，引起细胞非正常的生物学行为。已有相关研究结果显示[8-10]，在膀胱癌组织中microRNA-100的表达下调，对microRNA-100膀胱癌抑癌基因功能进行推测，具有对蛋白survivin表达量抑制促使凋亡减少的作用，可抑制细胞凋亡功能，增加膀胱细胞凋亡[11-12]。此次数据显示，膀胱肿瘤经转染的后T24细胞的survivin和VEGF蛋白显著减少，表示microRNA-100可以基因水平上对survivin基因片段以及VEGF基因片段的正常翻译和转录进行抑制译。MTT检查显示，相比较于对照组和空白组，实验组转染后细胞的增殖被抑制的比较明显，表示survivin、VEGF对膀胱肿瘤T24细胞增殖过程中进行参与。

表2 各组细胞培养24 h、48 h、72 h后测定细胞周期变化情况

综合以上结论，采取基因检测方法能够早期诊断和治疗膀胱癌，进一步阐述寻找膀胱癌疾病治疗中将microRNA当做靶标药物的依据。