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青海藏族肺结核患者与健康者循环miRNA表达差异性及海拔变化对患者miRNA表达水平的影响☆

2018-09-26颜然然冯喜英李玉红安文静刘洪千王玉清韩晓茹林宗斌

中国高原医学与生物学杂志 2018年3期
关键词:低氧海拔藏族

久 太,颜然然,冯喜英,李玉红,安文静,刘洪千,王玉清,张 娟,韩晓茹,林宗斌

(1.青海大学附属医院呼吸内科;2.青海大学,青海 西宁 810000;3.青海省第四人民医院)

临床研究显示,青海藏族人群罹患肺结核者较多,本研究选用miRNA基因芯片法、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法等,对青海地区藏族结核病患者循环血中miRNA在表达水平上做比较分析,筛选出差异性表达的目的基因并对其作用做相关研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.2 主要仪器与试剂

实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司),Thermo NanoDrop2000C核酸检测仪(美国Thermo公司),超低温冰箱(美国Thermo Fisher Scuentific公司),离心机(5810R,德国eppendorf公司),PCR仪(6325,德国eppendorf公司),RNA血样试管PAXgene RNA Tubes(货号:762165,美国BD公司),miRNA提取试剂试剂盒PAXgene Blood RNA Kit(货号:763134,德国QIAGEN公司),miRNA逆转录试剂盒miScript II RT Kit(货号:218160,德国QIAGEN公司),实时荧光定量PCR试剂miScript SYBR Green PCR Kit(货号:218073,德国QIAGEN公司),Human miFinder miscript miRNA PCR芯片(货号:MIHS-001ZA,德国QIAGEN公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 血液采集

受试者于晨起空腹时用PAXgene RNA Tubes采集静脉血2.5 mL,混匀,置-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 血浆miRNA提取

按照Qiagen miRNeasy PAXgene RNA Kit 说明书进行RNA提取,血样融化后离心(4000g)15 min,留取试管底部的沉淀,经无RNA酶水洗涤沉淀后加入Resuspension Buffer,沉淀转入洁净的EP管。依次加入Binding Buffer、PK溶液,涡旋使试剂与PBMC充分混匀,震荡孵育(55℃)10 min。充分裂解细胞,释放出miRNA。离心后将溶解有miRNA的上清液转移至离心柱,使miRNA挂留于离心柱的芯片膜上。用DNA消解液除去DNA杂质,洗去RNA消解液后极速离心(干燥离心柱芯膜),滴加RNase-free water,极速离心收集液体。采用核酸检测仪检测最终收集的含miRNA的溶液的质量,并记录OD、miRNA浓度值和A260/A280等测定结果。miRNA稳定性欠佳,各个样品检测完毕后要迅速储存于-80 ℃冰箱。同时在实验过程中应尽量避免反复冻融。

1.3.3 PCR阵列芯片检测

采用SYBR Green荧光染料检测病例组和对照组的血浆样品。严格按照SYBR Green qPCR Mastermix说明书进行操作,待逆转录试剂解冻后,依次将逆转录引物、反应底物、酶等等比配置反应体系,将提取的miRNA模板加入体系中混匀后离心,收集反应液使之聚于试管底部。用eppendorf 6325-PCR仪行逆转录。反应条件:37 ℃下孵育60 min,使miRNA与试剂充分进行逆转录反应,85 ℃下孵育5 min后终止反应。试验结束后所得转录产物稀释后行PCR荧光定量。cDNA溶液置-20 ℃冰箱保存(避免反复冻融,避免污染)。

以逆转录合成的第一链cDNA为模板进行基因芯片检测。反应试剂溶解混匀后按比例移取反应底物、聚合酶、SYBR Green荧光染料、PCR引物,混匀后加入模板cDNA,混匀离心,取室温下平衡好的96孔 qPCR基因阵列芯片加样。反应板置入ABI7500荧光定量PCR仪中,选取Quantitation-comparative Ct,即△△Ct选项,选择SYBR®Green Reagents选项,以标准速度进行PCR反应检测。充分激活DNA聚合酶反应条件设定为95.0 ℃,10 min,循环阶段采用95.0 ℃,10 s,使基因变性;62.5 ℃,20 s,退火,使反应酶与模板结合(准备基因逆转录);72.0 ℃,10 s,延伸复制,设定40个循环,并在延伸阶段进行荧光检测。

1.3.4 qRT-PCR验证

用实时荧光PCR法(结果结合文献资料)筛选出差异表达倍数较大的miRNA进行实时荧光定量PCR验证。提取的RNA逆转录后采用SYBR荧光染料定量检测。选取U6作为内参,反应条件设定为95 ℃,15 min;94 ℃,15 s;55 ℃,30 s;70 ℃,30 s。同样在延伸阶段采集荧光检测信号。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 miRNA提取的质量与数量

所有纳入研究对象的基本信息如表1所示。高、低海拔病例组白细胞数无差异,提示白细胞总数对高、低海拔肺结核患者发病影响不大。而高海拔组患者中性粒细胞百分比却显著低于低海拔组。高海拔结核组红细胞数显著高于低海拔,这些结果提示,以渗出、增生、坏死为基本病理变化的结核性病变因影响肺功能而加重缺氧程度,促进代偿性的红细胞数目增加。加之高海拔低氧环境重叠影响,机体氧供降低,代偿性红细胞增多。中性粒细胞是白细胞组成成分,中性比增高表明体内可能有细菌感染存在。低海拔病例组中性比高于高海拔地区,考虑与机体miRNA表达调控有关。所有样本提取的miRNA经Thermo Nanodrop2000C核酸检测仪进行质量检测,结果表明A260/280均>2.0,提取的miRNA样品纯净,miRNA含量>30 ng。所提取的miRNA符合芯片检测和qRT-PCR检测的要求。

Table 1General data of the study

*:与健康组比较,P<0.05;◆:与结核组比较,P<0.05。

2.2 血浆miRNA芯片PCR阵列检测结果

样品参数检测结果均达到质控要求。将高、低海拔地区病例组分别与其对应的对照组血浆miRNA表达结果对比。miRNA含量采用相对定量方法(2^-△△Ct)表示,PCR阵列芯片检测结果用Ct值表示,高海拔病例组样本相对于低海拔样本中miRNA的变化倍数(Fold Change,FC)用2^-△△Ct计算表达。FC>1.5表明miRNA表达量明显上调,FC<1.5表达量明显下调,代表两组间差异表达明显[2];设定筛选标准:CT值35,差异表达倍数FC>2[3]。基因芯片PCR阵列检测结果显示:共检测到84个基因。分析基因表达谱,高海拔病例组血浆中miRNA有15种表达上调,低海拔病例组22种表达下调。采用聚类分析方法处理获得实验结果,结果以miRNA聚类热图表示(图1),本图直观地看出检测基因中每一个检测样本的变化趋势。

图1miRNA差异表达聚类热图

Figure1ClusterheatmapofdifferentialmiRNAexpression

病例组与对照组miRNA表达结果以条形图表示(图2),本图直观地得出高海拔地区病例组与对照组的比较结果。

图2病例组、对照组miRNA差异表达图

Figure2DifferenceofMiRNAexpressionbetweenthecasegroupandthecontrolgroup

不同海拔病例组间miRNA表达分析结果以散点图表示(图3),本图显示,高海拔病例组miRNA较低海拔组有8种表达上调。

图3不同海拔病例组miRNA表达散点图

Figure3ScatterplotofmiRNAexpressionindifferentaltitudecasegroups

不同海拔病例组miRNA的比较情况以直条图表示(图4),本图显示了高、低海拔病例组miRNA的表达比较结果。

图4高低海拔结核组miRNA的比较图

Figure4ComparisonofmiRNAbetweenhighandlowaltitudetuberculosisgroup

2.3 血浆miRNA样品的qRT-PCR验证结果

miRNA表达谱检测结果显示高海拔地区藏族肺结核患者与低海拔地区患者相比,miRNA表达有差异性。筛选出的基因按照FC降序排列,参照张卫芳研究结论选取差异表达倍数较大且与低氧相关的miRNA(let-7e-5p、miR-144-3p[13])进一步验证。引物分别是,let-7e-5p:5′-AACTATACAATCTACTACCTCA-3′,5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGAGGTAGTAGATTGTATAGTT-3′;miR-144-3p:5′-AGTACATCATCATCTATACTGTA-3′,5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTACAGTATAGATGATGTACT-3′。

以U6为内参,计算采用 Ct(样本基因)减去Ct(内参基因)计算出每个样本的△Ct,再将高海拔地区病例组样本△Ct减去对照组△Ct,取所得结果的相反数,得到-△△Ct。此时所得结果有正负数不同的结果,mRNA表达量增加,上调则结果为正值,反之为负值,用-△△Ct表示表达量。高海拔地区藏族肺结核患者血浆miRNA表达量变化情况(表2)显示,高海拔病例组miR-30e-5p、miR-302-3p、let-7f-5p、let-7e-5p、miR-144-3p较正常对照组变化较大,且其变化倍数高于低海拔藏族肺结核患者。与芯片PCR阵列检测结果一致。

表2高海拔病例组miRNA差异表达的变化倍数(FC)

Table 2Variation multiples of miRNA differential expression in patients at high altitude

参照参考文献及相关生物信息学分析发现,经miRWalk、Pathway及功能富集分析[4,18],miR-144-3p同时参与MAPK、JAK-STAT及Wnt信号转导通路,抑制IFN-γ和TNF-α产生而抑制T细胞增殖[8]。而let-7e-5p作用于NF-κB通路。

3 讨论

目前,参与炎症调控的miRNA分子在高海拔藏族肺结核发病过程中的调控机制不明,也无针对性的关于藏族人群肺结核的基因标志物研究。因此,本研究针对青海高、低海拔地区藏族肺结核患者血液miRNA表达情况进行初步研究,并对差异miRNA的表达机制进行相关分析。

基因芯片筛选出差异表达miRNA,从高表达的基因中筛选出高海拔藏族肺结核患者表达差异较大且相关性较低的两个基因。如let-7e-5p在高海拔地区呈明显高表达,Fold Regulation为4.89,而较低海拔则为-1.08;miR-144-3p分别为4.89、-1.08;选定基因在高海拔藏族肺结核组明显高表达,FC>2,而在低海拔藏族肺结核组表达水平不高,甚至低表达。基因通路富集结果提示靶基因主要集中于JAK-STAT、MAPK、NF-κB等结核感染后免疫相关的信号通路上[5]。本研究结果提示,高低不同海拔藏族肺结核患者血浆miRNA表达谱存在明显的差异,且其可能通过调控免疫系统相关靶基因发挥作用。

MTB感染后诱发复杂的免疫反应。miR-144-3p、let-7e-5p的靶基因主要集中在IL-10、IPAK1、TRAF6的mRNA影响巨噬细胞。Toll样受体(Toll like receptor,TLR)作为巨噬细胞表面糖蛋白,可特异性识别入侵的MTB表面抗原决定簇,激活Jak-STAT、MAPK、NF-κB信号转导通路,引起非特异性免疫应答[6]。其中Jak-STAT通路激活后诱导巨噬细胞自我凋亡,降低机体抗结核免疫能力。同时释放出吞噬的MTB而感染扩散,降低机体免疫力而罹患肺结核。MAPK通道激活后,促进TNF-α、IL-10、MCP-1(单核细胞促化因子) 合成分泌,增强抗结核能力。同时激活NF-κB信号转导通路,经IPAK1、TRAF6蛋白调节后诱导产生NO合酶、NO,发挥抗结核杀菌作用。本研究中高表达的miR-144通过与IPAK1、TRAF6蛋白的mRNA相结合,抑制或降解靶基因mRNA,IL-1受体相关激酶1(IRAK1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)合成减少,TLR识别MTB功能降低,同时其靶基因IL-6、IL-8、IL-1b和TNF-α的表达降低[7];抑制MTB感染后机体的非特异性免疫反应[8],致免疫应答功能降低。同时高表达的miR-144作用于MAPK通路,抑制TNF-α、IFN-γ等细胞因子的合成分泌,降低获得性免疫应答,导致机体感染发病。由上可知,miRNA在结核感染发病过程中发挥着至关重要的作用。

时永辉研究发现[9],高原缺氧环境对血浆miRNA的表达有一定的影响。参考以往研究,可知环境低氧或缺氧性疾病情况下,血浆miRNA也会发生差异性表达。例如,同时参与低氧、炎症反应,且评分较高又与我们研究结果具有交集的miR-let-7家族、miR-130家族和miR-144[10]等,在低氧情况下,参与低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)活动。HIF-1作为参与抗炎反应关键调节因子[11],活化后与低氧反应元件相结合,激活靶基因,由MAPK和胞外信号调节激酶作用于基因、酶等,调节树突状细胞(DC),激活T细胞,影响免疫细胞分化、免疫细胞功能[12]。过表达的HIF-1同时通过信号转导子与转录激活子3和IL-12调节,抑制1型辅助T细胞分化,降低免疫应答[13]。全面分析可发现高原地区低氧环境作为诱导因素,可刺激HIF-1增多,调整机体状态适应高原环境。其中已知let-7e-5的表达与机体中HIF-1α具有明确的相关性[13]。低氧因素刺激HIF-1α高表达,高表达的HIF-1α作用于肺结核慢性炎症激活机制中NF-κB通路上重要调节蛋白IPAK1、TRAF6,使其表达量降低,抑制机体免疫机制。因此,当结核分枝杆菌感染后,与高表达的miRNA共同作用于巨噬细胞,减低识别吞噬作用,抵抗结核能力减弱,导致机体易感,出现高海拔地区藏族人群中肺结核发病率较高情况[1]。

综上所述,高原地区藏族人群肺结核高发可能与其特有高表达的基因有关。高原低氧诱导高表达的let-7e-5p、miR-144-3p等作用于免疫反应,抑制MTB感染后免疫应答使机体易感。这些特异表达的基因有可能成为高海拔地区藏族人群结核病的生物标志物。

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