王瑗媛 谭好臣（潍坊市峡山水库管理局，山东 潍坊 261000）

氮含量过高是引起水体富营养化的重要因素之一。水体中的有机氮依次经过氨化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌的作用，转化为NH4+-N、亚硝态氮、硝态氮、再转化为硝态氮、亚硝态氮，最后以氮气的形式从水体中释放出来，这是微生物法控制水体中氮含量过高的主要方式[1]。由上述氮代谢过程来看，氨化细菌是氮循环过程中的限速微生物，因此，分离高效氨化细菌对废水有机氮的降低，控制水体富营养化具有重要意义！

对氨化细菌的分离筛选的研究很多，目前已知的氨化细菌有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属（Pseudomonas）、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、变形杆菌属(Proteus)、沙雷菌属(Serratia)及微球菌属(Micrococcus)[2-4]。本研究是从山东某污水厂活性污泥中筛选、分离氨氮降解菌，对其形态、生理生化性质、氨氮降解能力以及分类学位置进行了分析，为污（废水）中高效氨化细菌的分离筛选以及水体富营养化控制提供一定的理论基础。

1 实验部分

1.1 材料、试剂和仪器

分离氨氮降解菌的活性污泥来自于山东某污水处理厂。

使用的化学试剂:硫酸铵、氯化钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸氢钠、对氨基苯磺酸、α-奈胺均为分析纯。

格里斯试剂配制：对氨基苯磺酸0.5克，溶入150mL 10%醋酸溶液中，得到溶液I；称取α-萘胺0.1克，加入到50mL去离子水中，煮沸，再缓缓加入150mL 10%醋酸溶液，得到溶液II。溶液I溶液II分别保存在棕色瓶中，待用。

1.2 培养基组成

氨氮降解菌富集培养基[5]组成(g/L)：(NH4)2SO42 g，NaCl 0.3 g, FeSO4·7H2O 0.03 g, K2HPO41g,MgSO4·7H2O 0.03 g,NaHCO31.6 g,H2O 1L,pH 7.2，121℃灭菌20min。固体培养基配制时加入琼脂粉(15 g/L），半固体培养基配制时加入琼脂粉（3 g/L）。

1.3 实验方法

1.3.1 氨氮测定

氨氮测定采用纳氏试剂分光光度法（国标法）。

1.3.2 氨氮降解菌富集及分离

取10 mL活性污泥加入到盛有200 mL富集培养基的三角瓶中，30℃条件下振荡（160r/min）培养，每隔1 d取培养液，用格里斯试剂检验亚硝酸盐的生成情况，根据红色深浅判断氨氮降解菌的繁殖情况。培养7 d后取10 mL富集培养液转接到新鲜的200 mL富集培养基中，重复上述操作3次。

取富集3次后的培养液0.03 mL划线培养到固体平板培养基上，30℃条件下静置培养7 d,分别取其中的单菌落重复划线培养3次，将纯化得到的12个单菌落分别保存到半固体氨氮降解菌富集培养基中，待用。

1.3.3 高效氨氮降解菌的筛选及其生理生化、生长曲线测定

对上述纯化得到的12个单菌落分别用富集液体培养基进行培养，每隔1d取培养液用格里斯试剂检验，根据颜色深浅比较不同菌株的氨氮降解能力，选取颜色变化最深的菌株并将该菌株命名为AN-1，菌株AN-1即为氨氮降解能力最强的菌。然后对菌株AN-1的生理生化性质进行测定，包括革兰氏染色、糖发酵实验、V.P实验、淀粉水解实验、MR实验、明胶水解实验、H2O2酶测定等，操作方法见参考文献[6]。

生长曲线测定：用液体富集培养基对菌株AN-1进行培养，培养基pH为7，培养温度为30℃，振荡培养（160r/min），每隔1 d测定培养液吸光度（OD560），作出时间-吸光度曲线。

1.3.4 不同条件对氨氮降解能力的影响测定

（1）不同pH条件对氨氮降解能力影响

将菌株AN-1接种到液体富集培养基中进行培养3 d， 分别取富集培养液5 mL接种到 pH分别为6.0、7.0,8.0和9.0的195 mL富集培养基中，30℃条件下振荡培养（160r/min）， 培养5 d后测定培养液中剩余氨氮含量，求出氨氮降解率。

（2）不同温度条件对氨氮降解能力影响

取1.3.4（1）中富集培养液5 mL接种到195 mL富集培养基中，分别在10℃、20℃、30℃和40℃条件下振荡（160r/min）培养5 d，测定培养液中剩余氨氮含量，求出氨氮降解率。

1.3.5 菌株AN-1的系统分类位置确定

（1）DNA提取

菌株AN-1 DNA的提取采用柱式基因组抽提试剂盒（UNIQ-10），提取方法按试剂盒说明书。

（2）PCR对菌株16S rDNA的扩增

PCR扩增引物采用细菌16S rDNA通用引物，引物序列：

正向引物7F：5´-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3´；

反向引物1540R：5´-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3´

（3）PCR反应体系以及反应条件

PCR反应体系（25μL）：2.5μL 5×Buffer（含Mg2+），0.5μL模板DNA，各0.5μL 7F（10uM）和1540R（10uM），1μL dNTP（各2.5mM），超纯水定容至25μL。PCR反应条件：98℃预变性3min；98℃变性25 S，55℃退火25 S，72℃延伸1min， 30个循环，再72℃延伸10min，PCR扩增的序列由上海生工生物工程公司进行测序。

（4）系统树的创建

将测得的16S rDNA序列发送到DDBJ(DNA Data Bank of Japan,http://www.ddbj.nig.ac.jp/）数据库中的Blast中进行比对，利用CustalX2.1和Mega5.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)软件创建系统树，采用的方法为邻接法（Neighbor-Joining）[7-10]。

2 结果

2.1 菌株的分离和筛选

首先利用格里斯试剂对富集培养液进行初步检测，筛选具有降解氨氮能力的菌株。然后对菌株进行多次驯化培养，最后用线培养法进行分离，共分离培养到12株氨氮降解菌，从中选取氨氮降解能力最强的菌株AN-1为代表菌株，用作后面的实验。

2.2 生理生化

菌株AN-1在固体平板培养基上生长时，其菌落为乳白色圆形，表面湿润光滑，显微镜观察该菌为杆状。根据《常见细菌系统鉴定手册》对氨氮降解菌AN-1的形态特征、生理生化特征等进行了鉴定,结果如表1所示。

表1 菌株AN-1的生理生化性质Table1 Physio-chemical properties of the strainAN-1

2.3 菌株AN-1生长曲线测定

将菌株AN-1在液体培养基中进行振荡培养，每隔1 d测定培养液的吸光度（OD560），并作成生长曲线，通过曲线得知菌株AN-1的停滞期较短，经过24 h左右的培养后便进入了对数增长期。在培养到72 h时生物量达到最大，在此后的培养过程中，生物量基本保持不变。

2.4 不同pH条件下的氨氮去除率

将菌株AN-1的接种到pH分别为6.0、7.0、8.0和9.0的培养基中进行振荡培养，培养温度为30℃，培养到5 d时，测定培养液中剩余氨氮含量，分别求出氨氮降解率，作出pH-氨氮降解率曲线，通过曲线得出菌株AN-1在pH 8.0左右表现出最高的氨氮降解率，为78%。pH为9.0的培养基中生长时，菌株AN-1的降解率仅有47%，pH为6.0时的氨氮降解率为50%。由此可见，菌株AN-1的氨氮降解最适pH值在8.0左右，pH过高和过低都不利于氨氮降解。

2.5 不同温度条件下的氨氮去除率

分别在10℃、20℃、30℃和40℃条件对菌株AN-1进行振荡（160r/min）培养5 d，培养基pH均为8，每隔1 d测定培养液中氨氮含量，求出氨氮去除率并作温度-氨氮去除率曲线，如图3所示。从图1可以看出，菌株AN-1在30℃培养时，氨氮去除率最高，达77%。10℃条件下培养，其氨氮去除率仅为20%，40℃培养条件下的氨氮去除率为25%，稍高于10℃培养条件下的氨氮去除率。由此结果可以看出，菌株AN-1适宜生长的温度为30℃左右，温度过高或过低，都会降低其氨氮去除率。

图1 培养温度对菌株AN-1氨氮去除率影响Fig.3 The effect of cultivation temperature on NH4-N removal for strainAN-1

2.6 氨氮降解菌系统分类位置

经过序列测定，菌株AN-1的16S rRNA的基因片段为1398 bp。通过数据库DDBJ(DNADataBankofJapan,http://www.ddbj.nig.ac.jp/），获得菌株AN-1的登录号为 AB917468。在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据中，选取与菌株AN-1 16S rRNA序列同源性较高的基因序列，利用软件CustalX2.1和Mega5.0创建系统树（图2）。利用NCBI数据库对菌株AN-1的16 S rRNA序列进行同源性分析，结果表明菌株AN-1与Shinella kummerowiae（EF070131）相似度最高，为96%。结合菌株AN-1在系统树中的位置，可以判断菌株AN-1属于申氏杆菌属,并初步命名为Shinella sp.AN-1(AB917468)。

图2 菌株AN-1（AB917468）与申氏杆菌属（Shinella）中近缘菌株16S rDNA序列的无根系统发育树，采用方法为紧邻法Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences showing the position of strainSKD-1within the family Shinella.Bar,0.005 substitutions per nucleotide position.

3 讨论

本研究以氨氮（(NH4)2SO4）为唯一氮源配制培养基，从污水处理厂活性污泥中分离得到一株高效降解氨氮的细菌Shinella sp.AN-1(AB917468)，对其生理生化性质、不同培养条件下的氨氮去除率以及分离学位置进行了分析。结果表明：细菌Shinella sp.AN-1(AB917468)为革兰氏阴性菌，最适宜的生长条件为pH 8.0、温度为30℃，此条件下的氨氮去除率最高，达78%。细菌Shinella sp.AN-1(AB917468)的16S rRNA序列分析表明，该菌株与申氏杆菌Shinella kummerowiae（EF070131）相似度最高，为96%，结合菌株在系统树中的位置，确定菌株AN-1属于申氏杆菌属。实验证明，本研究筛选到的申氏杆菌Shinella sp.AN-1(AB917468)具有较强的去除水体中氨氮的能力，为高氨氮废水如养殖废水中去除氨氮提供了新的菌种资源。但如要应用到实际的氨氮废水处理中，还需要对具体的环境因素进行分析。另外，如果对菌株AN-1进行新菌种鉴定还需要进行DNA-DNA杂交，DNA G+C含量测定、脂肪酸组成分析等工作。