运立媛，张民，朱振元

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

糖尿病是最严重的疾病之一，它对健康，生活质量，人的寿命以及现代医疗保健系统都有重大影响[1]。因此，寻找安全有效的治剂成为人们的研究热点。越来越多的研究者从植物中提取出具有降血糖的活性成分来治疗糖尿病。

黄芪，是一种多年生草本植物，广泛分布于世界各地的温带地区，是一种多年生植物[2]。黄芪的干根，在神农本草经中被记载，是中国2000多年来最流行的对人体健康有益的中草药之一[3]。现代植物化学和药理试验证明，多糖是黄芪根的主要活性成分之一，具有多种重要的生物活性，例如造血功能、神经保护[4]、抗氧化剂[5-6]、保护内皮细胞[7]、免疫调节[8]、抗肝炎病毒[9]、降血糖等活性[10]。有报道指出黄芪多糖对糖尿病小鼠有显著的低血糖作用[11]。由于自然环境的不同，因此导致黄芪的品质不同。本研究旨在探讨不同地区黄芪多糖的活性的差异，为黄芪在降血糖活性的应用上提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄芪（Astragalus membranaceus）根：来源于山西、甘肃、四川、贵州、新疆、内蒙古、大兴安岭，经鉴定均为膜荚黄芪。木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡聚糖-2000、葡聚糖-500、葡聚糖-110、葡聚糖-70、葡聚糖-40、葡聚糖-10、α-葡萄糖苷酶（125 U/mg）、阿卡波糖：美国 Sigma公司；对硝基苯-α-D-葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）、链脲佐菌素（streptozocin，STZ）：国药集团化学试剂北京有限公司；无水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、硫酸、三氟乙酸、醋酸酐均为分析纯；小鼠维持饲料：斯贝福北京生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温水浴锅（HWS26）：上海一恒科技有限公司；冷冻干燥机（Modulyod-230）：美国 Thermo公司；高效液相色谱仪（LC-20AT）、示差折光检测器（RID-20AT）、凝胶色谱柱（SB-805HQ）：日本岛津公司；血糖监测仪（EZ III）：Acon生物技术有限公司。

1.3 多糖的提取

将清洗后的黄芪根置于50℃烘箱，烘干24 h，粉碎，过60目筛，备用。称取50 g样品无水乙醇回流脱脂[12]，向脱脂后样品中加入10倍体积的蒸馏水，于80℃下提取2 h，共提取3次，合并提取液，60℃下对滤液浓缩，浓缩至300 mL，向浓缩液中加入4倍体积的95%乙醇进行沉淀，于4℃条下沉淀15 h，Sevage试剂（三氯甲烷 ∶正丁醇=4∶1，体积比）除蛋白[13]，溶液真空浓缩，冷冻干燥[14]，得粗多糖。多糖得率计算公式为：

式中：m1为黄芪多糖质量，g；m2为黄芪质量，g。

通过苯酚硫酸法对样品中的中性糖含量进行测定，以葡萄糖为标准品[15]；通过二硝基水杨酸法（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）法对还原糖含量进行测定[16]。

1.4 黄芪多糖单糖组成分析

向5 mg黄芪多糖样品中，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA），于110℃反应3 h。冷却后用N2吹干残余的TFA，加少量甲醇，用N2吹干，反复3次以除尽TFA。向酸降解产物中加入10 mg盐酸羟胺，2 mg肌醇六乙酸乙酯，0.5 mL吡啶，混合均匀后密封，于90℃反应30 min。反应30 min后冷却至室温，向反应管中加入0.5 mL醋酸酐，于90℃继续反应30 min。生成糖腈乙酸酯衍生物，将衍生物通过N2吹干后，加入1 mL二氯甲烷重新溶解，通过0.22 μm滤膜进行过滤。取1 μL进行气相色谱分析[17]。以单糖（葡萄糖，半乳糖，鼠李糖，木糖，甘露糖，阿拉伯糖）衍生化的产物作为对照。根据各峰的峰面积计算摩尔比。

1.5 黄芪多糖分子量的测定

通过SB-805HQ凝胶色谱柱结合示差检测器对黄芪多糖进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。蒸馏水配制浓度为5mg/mL的多糖溶液，0.22 μm 滤膜过滤，进样量为 20 μL，流速为0.6 mL/min，超纯水作流动相。以T-系列葡聚糖（T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000）为标准品，以保留时间为横坐标，分子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线[18]，通过标准曲线计算多糖各组分的分子质量。

1.6 α-葡萄糖苷酶抑制活力测定

肠道内的葡萄糖产生可以通过α-葡糖苷酶抑制剂进行抑制，从而降低餐后血糖的升高[18]。阿卡波糖等α-葡糖苷酶抑制剂是常见且有效的治疗Ⅱ-型糖尿病的临床治疗药物。

试验分为抑制剂组与对照组[19-20]。抑制剂分别为不同产地的黄芪多糖及阿卡波糖。向抑制剂组分别加入400 μL抑制剂及400 μLα-糖苷酶（1U）。抑制剂对照组分别加入400 μL抑制剂及400 μL磷酸盐缓冲液（pH 7.0）；空白组分别加入400 μL磷酸盐缓冲液及400 μL α-糖苷酶（1U），空白对照组中加入 800 μL 磷酸盐缓冲液（pH7.0），于37℃反应20 min。之后向每组中加入100μLpNPG（100mmol/L）于37℃反应40min。最后以1.5 mL NaOH溶液（1.0 mol/mL）以停止反应的进行，于410 nm处测各组的吸光度值。抑制率计算公式为：

式中：A1为抑制剂组吸光度值；A2为抑制剂对照组吸光度值；A3为空白组吸光度值；A4为空白对照组吸光度值。

1.7 动物实验

雄性昆明小鼠[（20±2）g，证书号：SXCK（津）2014-0008）]由中国医学科学院中心（北京）提供。饲养温度保持在（22±2）℃，环境湿度（55±10）%，自由饮水，摄取维持饲料。

1.7.1 Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立

小鼠在培养环境中适应6天后，除空白组，其他小鼠于腹腔内注射160 mg/kg·BW的新鲜制备的pH4.5的链脲佐菌素（STZ）溶液。注射链脲佐菌素72 h后，通过血糖监测仪进行测试，当血糖水平超过11.1 mmol/L时，被认为是造模成功的Ⅱ型糖尿病小鼠，可用于后续实验。

1.7.2 实验动物的分组

将STZ诱导小鼠随机分成9组，每组10只。分别为空白组（NC），模型组（DC），阿卡波糖阳性对照组（PC），山西黄芪多糖组（SX），甘肃黄芪多糖组（GS），四川黄芪多糖组（SC），贵州黄芪多糖组（GZ），新疆黄芪多糖组（XJ），内蒙古黄芪多糖组（NMG），大兴安岭黄芪多糖组（DXAL）。多糖灌胃剂量为120 mg/kg·BW。

所有的小鼠都采用灌胃的方式给药，连续灌胃4周。在整个过程中，小鼠以维持饲料喂养。每周通过血糖仪测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）值。

1.7.3 口服糖耐量的测定

糖耐量是指人体对摄入的葡萄糖具有很大耐受能力的现象。在实验最后一天前12小时禁食。尾静脉采血测血糖值，对小鼠灌胃40%葡萄糖溶液，灌胃剂量为2.5 g/kg·BW。灌胃后测0、30和120 min的血糖值并计算血糖曲线下面积（area under curve，AUC）。

曲线下面积（AUC）=0.5×空腹血糖值+30 min血糖值+1.5×60 min血糖值+120 min血糖值

1.8 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同产地黄芪粗多糖得率及含量分析

通过热水提取、Sevage除蛋白、乙醇醇沉、冷冻干燥后得黄芪粗多糖。通过苯酚硫酸法对不同产地黄芪多糖的含量进行测定，结果如表1。

表1 不同产地黄芪多糖的得率及糖含量分析Table 1 The analysis on the yield and sugar content of Astragalus polysaccharide from different regions %

多糖含量由高到低分别为：四川＞贵州＞甘肃＞内蒙古＞山西＞新疆＞大兴安岭。多糖得率如表1所示，得率由高到低分别为：山西＞新疆＞大兴安岭＞甘肃＞内蒙古＞贵州＞四川。由结果可以看出，不同产地黄芪多糖得率与含量存在着显著的差异。

2.2 不同产地黄芪多糖单糖组成及分子量分析

多糖结构和物理化学性质是影响多糖生物活性的主要因素。单糖组成和分子量在多糖的活性中起着关键的作用。不同产地黄芪多糖的单糖组成及分子量分析如表2所示。

表2 不同产地黄芪多糖单糖组成及分子量分析Table 2 Molecular weight distribution and monosaccharide composition of crude Astragalus polysaccharide

试验结果表明，不同区域的多糖具有不同的摩尔比，且内蒙古、大兴安岭的黄芪多糖主要含有木糖。通过HPLC法对不同产地黄芪多糖的分子量进行分析。通过标准曲线计算出多糖的平均相对分子质量，结果如表2所示。由结果可以看出，不同产地黄芪多糖的相对分子质量存在的差异，且各产地的黄芪多糖均含有两个组分。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性

阿卡波糖与不同产地黄芪多糖的葡萄糖苷酶抑制活性如图1所示。

由图1可以看出葡萄糖苷酶的抑制活性与多糖浓度呈量效关系，且内蒙古和大兴安岭的黄芪多糖均表现出明显的抑制活性。这可能是由于相对分子质量和单糖成分的差异造成的。

图1 不同产地黄芪多糖的α-葡糖苷酶抑制活性Fig.1 α-glucosidase inhibition activity of crude Astragalus polysaccharides in different regions.

2.4 体内降血糖实验

2.4.1 不同产地黄芪多糖对小鼠体重及脏器指数的影响

体重的减少是糖尿病的常见特征[21]。传统上的Ⅱ型糖尿病治疗与体重相关。在此研究中，每周对9组糖尿病小鼠进行体重的测定，结果如表3所示。

表3 不同产地黄芪多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠的体重及脏器指数的影响Table 3 The effect of Astragalus polysaccharide from different regions on the weight and organ index of typeⅡdiabetes mellitus mice

经过4周的治疗，所有的糖尿病小鼠体重都有所增加。然而，模型组糖尿病小鼠的体重仍然显著低于正常小鼠（p＜0.01），肝脏，胰腺，胸腺和脾脏的重量明显降低（p＜0.01）。黄芪多糖组中小鼠体重的增加和器官指数的增加意味着黄芪多糖可有效地缓解Ⅱ型糖尿病。与模型组相比内蒙古黄芪多糖药物组与黄芪多糖药物组脏器指数增加的更显著（p＜0.01）。

2.4.2 不同产地黄芪多糖对空腹血糖水平的影响

不同产地黄芪多糖对糖尿病小鼠血糖水平的影响见图2。

由图2可以看出，经STZ注射后，与正常组相比，模型组空腹血糖显著升高（p＜0.01），说明链脲佐菌素可造成小鼠胰岛损伤，导致胰岛素分泌不足。与模型组相比，黄芪多糖组中小鼠的空腹血糖均有所降低，且在第四周后，内蒙古与大兴安岭多糖组小鼠血糖值分别显著降低47.83%与49.49%。

2.4.3 不同产地黄芪多糖对糖尿病小鼠糖耐量的影响

不同产地黄芪多糖对糖尿病小鼠糖耐量的影响见图3。

口服葡萄糖耐量实验如图3a所示，所有实验组小鼠的血糖水平在30 min时达到峰值，120 min后，血糖值有均呈下降趋势，且正常组小鼠血糖值逐渐恢复到正常水平。如图3b，根据曲线下面积（AUC）可以看出，与正常组相比，模型组的曲线下面积显著升高（p＜0.01），与模型组相比，黄芪多糖实验组中，各组的曲线下面积均有所降低，且内蒙古黄芪多糖组和大兴安岭黄芪多糖组小鼠葡萄糖耐量显著降低（p＜0.01）。

图2 不同产地黄芪多糖对糖尿病小鼠血糖水平的影响Fig.2 Effect of APS from different regions on fasting blood glucose levels in diabetic mice

图3 不同产地黄芪多糖对糖尿病小鼠糖耐量的影响Fig.3 Effects of APS from different regions on glucose tolerance in the diabetic mice

3 结论

由试验结果可知，不同产地的黄芪多糖在分子质量，单糖组成，单糖摩尔比上存在着差异，且内蒙古与大兴安岭黄芪多糖主要由木糖组成。α-葡萄糖苷酶抑制活性与体内降血糖活性表明，不同产地的黄芪多糖均有降血糖效果，且内蒙古和大兴安岭的黄芪多糖降血糖活性最显著。