林 峰， 肖月娥, 周翔宇， 唐 颖， 高步红

(1. 南京林业大学，江苏南京210037； 2. 上海植物园，上海200231； 3. 上海辰山植物园，上海201602)

核基因组大小是指单套染色体组的DNA含量，C值指生物体不复制的单倍体细胞核(无论倍性水平)的DNA总含量。Greilhuber和Bennett[1]为了区分与理解两者的关系，提出了“1C值”、“1CX值”的概念，分别对应整倍体和一倍体的基因组大小。对于二倍体生物，1C=1CX；对于多倍体，1C>1CX。基因组大小对许多研究领域至关重要，包括研究植物的分类、进化、规划基因组测序等方面[2]。测定基因组大小的方法主要有3种：基因组测序法、孚耳根微显影(Feulgen microdensitometry)以及流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)，FCM因方便、快速、可靠而成为首选方法。该法的样品制备通常只需要几分钟，不需要昂贵的试剂，分析速度快，即测即得，在以往研究中被广泛应用[3]。

鸢尾属(IrisL.)属鸢尾科(Iridaceae)，也是鸢尾科中最大和最复杂的属。据统计目前已知的鸢尾属植物共计300余种。鸢尾属植物生长的气候带以北温带为主，分布区域集中在亚洲、欧洲及北美洲。我国也是鸢尾属植物的分布中心之一，已知的种有64个，变种13个，此外还有1个亚种和6个变型主要分布于西南、西北和东北。该属植物具有广泛的生物活性，包括抗炎类丰富，抗氧化剂和癌症化疗防护性能。据报道，鸢尾属大约有二百多个化合物，其中包括黄酮、异黄酮及其苷类、萜类和芪苷类。目前，该属植物在国内外已被广泛研究和应用。研究内容包括分类[4]、育种[5]、生理[6]、生化[7]、种质资源[8]等各个方面。

根据DNAC值库(http://data.kew.org/cvalues)[9]查询，国外已报道了38份、共计35种鸢尾草植物C值的检测结果，占该属6%，国内尚无鸢尾属相关检测的报道。本研究以25 份鸢尾属嫩叶材料为基础，利用流式检测手段对其进行基因组大小检测，旨在为鸢尾属的基因组学、细胞生物学和种质资源研究提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1待测样品与标样 内标玉米(Zeamays‘CE-777’)、番茄(LycopersiconesculentumL. ‘Stupicke polni tyckove rane’)由捷克共和国科学院植物研究所分子细胞遗传学与细胞术实验室的Dolezel教授惠赠，与25份鸢尾一同在上海辰山植物园科研苗圃栽培。本试验均使用播种后1～3个月的嫩叶为材料。

1.1.2仪器与试剂 流式细胞仪型号为Influx (美国BD公司)；滤网、荧光染料、鞘液、培养皿、试剂均购自南京博巧生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1解离液与荧光染料配置 选用LB01为解离液，其配方为(15 mmol·L-1Tris，2 mmol·L-1EDTA Na2，0.5 mmol·L-1四盐酸精胺，80 mmol·L-1KCl，20 mmol·L-1NaCl，0.1%(v/v)TritonX-100，pH=7.0～8.0)。碘化丙啶(propidium iodide,PI) 配置至终浓度为50 μg·mL-1，药品均于4℃冰箱保存。

1.2.2细胞核悬液制备与DNA特异性染色 向塑料培养皿中加入1 mL(LB01)解离液，先放入1.5 g左右的样品嫩叶，再放入0.5 g左右的番茄嫩叶(或玉米嫩叶1.5 g左右)，用锋利的刀片快速切碎，将培养皿摆成斜面，使液体和切碎的材料流至皿底半弧侧，用枪头轻吸打液体，吸取培养皿中的解离液(弃去碎材料)于1.5 mL EP管，用400目滤网过滤，并置于冰中孵育5 min。离心：转速1 100 r·min-1，温度4℃，时间5 min。吸除上清液，再加入150 μL冰解离液。在250 μL解离液中加入0.5 μL PI储备液，使终浓度达100 μg·mL-1，再加入终浓度为10 μg·mL-1的RNase，避光，在冰箱孵育3～5 min。上机检测：低速(上样速度约500～1 000个颗粒·秒-1)、收集10 000个颗粒。

1.2.3确定对照与处理荧光强度大致范围 采用番茄、玉米作为内标，在上机检测中，先分别以两种内标单独上机检测，初步确定内标的相对荧光强度范围，保存检测模板，在同一检测模板下，随机选取三个鸢尾，确定其相对荧光强度范围，作下记录，结合机器的调节条件及便于识别，本试验所有的内标峰均为P1峰，样品峰为P2峰(如图1、图2)。

1.2.4两种内标的采用 由于样品与内标的C值大小相差太小或者太大，将造成峰形的重叠或者无法同时呈现在一张图上，25份鸢尾均分别采用了番茄、玉米嫩叶为内标，其中13种鸢尾采用番茄、9种鸢尾采用玉米为内标，其余3种则分别采用上述两种嫩叶内标。

1.3 数据分析

荧光染料PI的激发波长为488 nm，收集通道为FL2(670±30 nm)、检测PI的发射荧光强度。变异系数(coefficient of variation,CV)控制在5%以内。使用BD Influx自带软件FACSTM Sortware 1.0.0.650 进行分析。番茄1C基因组大小为958 Mbp[10]，玉米1C基因组大小为2 655 Mbp[11]，根据公式[12]：待测样本的细胞核DNA含量(=对照样本细胞核DNA含量×(待测样本G0/G1峰荧光强度/对照样本G0/G1峰荧光强度)。每个样本做3～6次平行试验，选取CV值最小的3次结果进行计算，使用SPSS 19进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 基因组C值的分析

如图1所示，P1峰代表番茄的相对荧光强度，P2分别代表样品的相对荧光强度：编号1A～1F的直方图中，P2峰分别代表：华夏鸢尾2 (Iriscathayensis)、野鸢尾(白花)(I.dichotoma)、喜盐鸢尾(I.halophila)、扇形鸢尾(I.wattii)、鸢尾7(I.tectorum)、鸢尾6(I.tectorum)。如图2所示，PI峰代表玉米的相对荧光强度，P2分别代表样品的相对荧光强度：编号2A～2F的直方图中，P2峰分别代表：扇形鸢尾(I.wattii)、鸢尾7(I.tectorum)、鸢尾6(I.tectorum)、马蔺(I.lactea)、膜苞鸢尾1(I.scariosa)、鸢尾4(I.tectorum)。

图1 番茄与6种鸢尾样品混合样品流式细胞仪测定结果Fig.1 Test results of Lycopersicon esculentum and Iris samples mixed samples using FCM注：P1峰：番茄内标；P2峰：鸢尾样本Note:Peak1:L.esculentum;Peak2:Iris samples

图2 玉米与6种鸢尾样品混合样品流式细胞仪测定结果Fig.2 Test results of Z.mays and Iris samples mixed samples using FCM注：P1峰：玉米内标；P2峰：鸢尾样本Note:Peak1:Z.mays;Peak2:Iris samples

2.2 与同属物种C值的比较

全世界鸢尾属植物约有300种，目前仅38份共计35 种的C值被测定，1C值范围在4.00～28.20 pg之间，其中4.00～8.00 pg的有16种，8.01～13.00 pg的有17种，大于12.00 pg的有5种，分别占已测种的42.1%、44.7%和13.2%，鸢尾种间C值差异较大。本研究计算得到的结果见表1、表2。最大的1C值为膜苞鸢尾1(6.77 pg)、最小的为小鸢尾(2.62 pg)。单因素方差分析表明，25份鸢尾材料被分成15组，组间有显著性差异(P<0.05)，鸢尾的C值大小差异性较大，这与此前报道的同属植物C值差异大的情况吻合。

表1 25份鸢尾属植物的C值Table 1 Genomic C values of 25 Iris samples

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

Note：Different lowercase letters in same column indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.3 种鸢尾采用两种内标的比较

由于本次试验采用两种内标，为了验证两种内标的可靠性，选择了扇形鸢尾及鸢尾 6、鸢尾 7为代表，分别以玉米与番茄作内标，并计算1C值大小，方差分析结果表明，用两种内标测定的C值无显著性差异(表2)，即番茄或玉米均可作为鸢尾属植物的内标。

表2 两种内标分别测定3种鸢尾属植物的C值Table 2 Genomic C values of3 Iris samples by 2 different Internal standard

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

Note：Different lowercase letters in same column indicate significant difference at the 0.05 level

3 讨论

方差分析表明，25份鸢尾属的DNAC值可分为15组，组间具有显著差异，同一种鸢尾、来自不同引种地的样品之间也存在显著性差异；如三份华夏鸢尾，其中引种地同为南京的两份无显著性差异，而与引种地为山东的鸢尾有显著性差异，1C值为3.08～3.24 pg。两份引种地同为新疆的膜苞鸢尾1C值分别为6.20 pg、6.77 pg；两份小花鸢尾1C值分别为6.27 pg、6.16 pg，也都具有显著性差异。7份鸢尾的1C值变化范围从3.80～4.26 pg不等。以上材料组间虽然有显著性差异，但是1C值相差并不大，差距在±0.50 pg以内。两份野鸢尾则无显著性差异，1C值分别为3.03 pg和3.08 pg。Hanson等[13]测试了2份萱草状鸢尾(I.tubergeniana)，其1C值分别为9.39 pg和11.03 pg；两份替代鸢尾(I.vicaria) 的1C值分别为8.46 pg和15.03 pg；两份白边鸢尾(I.albomarginata) 1C值分别为10.18 pg和18.83 pg，可见，同一种的鸢尾很可能C值大小不一。基因组大小的变化可能归因于染色体片段的扩增和缺失导致重复序列拷贝数的变化[14]。Knight[15]等综述了与植物DNA含量变化相关的因素，例如物种多样性、海拔、纬度、温度、降水、种子质量等。本次的25份鸢尾引种自湖北、四川、北京等14个省市(自治区)，引种地之间的气候、海拔、降水等差异较大，很可能导致其1C值间的显著性差异。

FCM测定基因组大小的要求一个已知的基因组参考标准，内部标准(内标)可以防止因仪器漂移或染色不均匀而导致的误差[16]。本次实验均采用内标进行测定。在前处理过程中，若以番茄为内标，由于鸢尾属的叶片比番茄硬、厚，可先切好鸢尾的叶片后再加入番茄叶片切碎，且鸢尾属植物的叶片需要多放一些。若以玉米为内标则可以遵循1:1的原则，放入面积相似的叶片同时切碎即可。在上机检测中，要关注液流变化，确保仪器一直处于在最佳状态；可以在FSC或FL2设置阈值，尽量保持内标峰与样品峰高度一致。

在检测基因组大小的试验中，通常使用1种内标[17]，本次试验待测的植物样品较多，为了使样品峰和内标峰不重叠、距离适中、CV值小，使用了玉米和番茄两种内标，且挑选了其中的3种鸢尾属植物，采用了双标进行验证，方差分析表明，用两种内标分别测得的基因组DNAC值无显著性差异，数据结果可靠，单内标通常需要3～6次重复，而两种内标只需要两次测定即可相互验证，该方法可以更加高效。

4 结论

本试验基于流式细胞仪术测得25份鸢尾属的DNAC值，鸢尾属植物的C值变化较大，DNA 1C值最大的为6.77 pg，最小的为2.62 pg。流式细胞术通过测定DNA含量和基因组大小，可预测该品种的未知染色体数目，从而使基因和基因组分析更有效，该技术也可为鸢尾属植物资源的收集、鉴定、保护和育种等提供理论依据。