许金根, 蔡治华, 王立克

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

CD4蛋白为CD4+T细胞表面的标志物，是动物机体中的一种重要免疫分子。CD4主要表达于辅助性T细胞，通过识别MHCⅡ类分子结合的抗原而参与免疫应答[1-2]。CD4是研究动物免疫性状的重要功能候选基因，已报道CD4序列遗传变异与畜禽的疾病或免疫性状相关。比如，CD4基因甲基化程度与奶牛的乳房炎相关[3]，而CD4基因变异与小型猪的血清IgG浓度相关[4]。选择性剪接是真核生物基因一个前体mRNA通过不同剪接方式产生多个剪接异构体，从而表达具有不同生物学功能的蛋白质，是形成生物多样性的一种重要方式[5]。研究表明，动物体的CD4基因存在选择性剪接现象。在小型猪中发现两种CD4分子，但两种CD4类型猪的CD3+和CD8+细胞数以及血清IgG和IgM浓度都没有显著差异[6]。另外，本人已在大白猪血液和组织中检测到两种相差外显子8(长122 bp)的CD4 mRNA序列，导致两者编码的CD4蛋白相差60个氨基酸[7]。但这种CD4基因整个外显子8缺失现象，尚未在奶牛等其他畜禽研究中报道。

基于前期在猪CD4基因外显子8处检测到的选择性剪接体。因此，本试验利用反转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)和测序，检测奶牛CD4基因外显子8处的剪接体，为研究奶牛CD4基因的结构和功能提供相应基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集1头成年荷斯坦奶牛3 mL尾静脉血，立即加入9 mL RNAfixer保护剂(北京百泰克生物技术有限公司)充分混合，静置10 min后于-70 ℃保存。用RNA提取试剂盒(QIAGEN凯杰生物技术有限公司)提取血液总RNA，经NanoDrop核酸分析仪测定其浓度和纯度，质检合格后(OD260/280在1.8～2.0，OD260/230>1.8)，再用反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)将总RNA反转录成cDNA。

1.2 引物设计

根据Ensembl数据库普通牛(Bos taurus) CD4基因序列(ENSBTAG00000003255)，并结合NCBI牛CD4 mRNA序列(GenBank: AB674571.1)，通过序列比对区分出牛CD4基因各外显子的位置。用Primer 5.0软件在牛CD4基因的外显子8两侧设计一对引物(表1)，用RT-PCR扩增和鉴定CD4外显子8处的剪接体。

表1 牛CD4基因扩增引物

1.3 RT-PCR扩增和测序

以奶牛血液cDNA为模板，用引物扩增CD4基因外显子8两侧序列。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性35 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，35个循环；72 ℃终延伸8 min。将PCR产物送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，用DNAMAN软件比对序列，并用Chromas软件查看测序峰图。

1.4 序列分析

通过在线序列比对(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)，比较分析不同CD4剪接体序列，并寻找单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。

2 结果与分析

2.1 奶牛CD4基因剪接体鉴定

用RT-PCR在奶牛CD4基因外显子8处检测到两种剪接体，与预期扩增长度542和420 bp一致，分别命名为CD4-1和CD4-2，且CD4-1在血液中的表达量高于CD4-2(图1)。

图1 牛CD4基因外显子8处剪接体扩增

2.2 奶牛CD4基因扩增序列分析

通过与GenBank (AB 674571.1)公布的普通牛CD4序列比对，发现本试验扩增的CD4-1序列(去除两端测序较差序列)与其高度一致(图2a)，表明扩增的是牛CD4基因部分mRNA序列。另外，通过测序，在CD4基因外显子8的第64位，检测到1个SNP (C/A变异) (图2b)。

图2 牛CD4基因外显子8处序列分析

2.3 两种奶牛CD4剪接体序列分析

通过序列比对分析(去除两端测序较差序列)，发现扩增的牛CD4-1和CD4-2序列长度相差122 bp (图3)，为整个外显子8缺失。

3 结论与讨论

前期研究结果表明，猪CD4 mRNA发现存在两种相差122 bp(缺失整个外显子8)的序列，两者编码的蛋白质相差60个氨基酸(GenBank: KC 333253和KC 333254)[7]。本研究利用RT-PCR和测序，在奶牛血液中检测到两种相差122 bp(缺失外显子8)的CD4 mRNA序列，且剪接型CD4表达量较低。GenBank数据库(ID: AB 674571.1和NM 001103225.1)和Ensembl数据库(ID: ENSBTAT00000037742.4和ENSBTAT00000004219.4)都公布有两种牛CD4 mRNA序列，通过序列比对发现短的编码区也是缺失长122 bp的外显子8，导致两者编码的蛋白质相差60个氨基酸，表明牛CD4基因外显子8处存在选择性剪接现象。

图3 牛CD4基因外显子8处两种剪接体序列分析

此外，通过Ensembl数据库检索其他物种CD4基因mRNA序列，发现人(ENST 00000011653.8)、绵羊(ENSOART 00000006854.1) CD4基因的第8外显子都是长122 bp，但是否也存在缺失整个外显子8的现象仍需验证。已有报道，利用单克隆抗体CC26鉴定出牛CD4蛋白存在不同的异构体[8]。鉴于CD4蛋白是维持和发挥CD4+ T细胞免疫功能的重要分子，故表达不同CD4蛋白的个体间免疫应答能力可能存在差异。本试验初步发现了牛CD4基因外显子8缺失，但剪接型CD4蛋白在机体中的生理功能有待进一步的研究。

综上所述，本试验发现牛CD4基因外显子8存在缺失，并检测到外显子8有一个SNP，为研究CD4基因的结构和功能奠定一定基础。