掲伟，林江飞，肖强胜，聂晚频

（中南大学湘雅三医院 普通外科，湖南 长沙 410006）

胆囊癌（gallbladder cancer）是胆道系统最常见的恶性肿瘤，以恶性程度高，侵袭力强，转移快，预后差为主要临床特征[1]。手术切除仍是目前胆囊癌治疗的首要方案，但大多数患者术后肿瘤复发率高，预后较差[2]。据报道[3]，胆囊癌中位生存期低于1年，5年生存率低于15%。为此，进一步阐明胆囊癌发生发展的分子机制，并寻找新的分子标志物对胆囊癌的防治具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度由19～24个核苷酸组成的单链非编码 RNA[4]。miRNA可通过与靶基因信使RNA（mRNA）3'-非编码区（UTR）碱基特异性互补配对而抑制其翻译，从而在转录后水平发挥对靶基因的直接调控作用[5]。研究[6]表明，miRNA与细胞生长、分化、凋亡及免疫反应等过程密切相关。

近年来研究[7]显示，一些miRNA的异常表达与人体肿瘤发生发展密切相关。例如，miR-217和miR-23a在胰腺癌中呈现异常表达，过表达miR-217可抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭[8]；而上调miR-23a则促进胰腺癌细胞迁移及侵袭[9]。miR-125a-5p在骨肉瘤呈现低表达，而体外增加其表达可显著抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭[10]。miR-106a和miR-20a在胶质瘤中呈现高表达并发挥促癌作用[11]。miR-200c在膀胱癌中表达上调，并促进肿瘤细胞的转移[12]。miR-362-3p定位于人基因组Xp11.23区域，其在多种人类肿瘤组织中低表达并发挥抑癌作用，如乳腺癌[13]、宫颈癌[14]及肾癌[15]等。目前关于miR-362-3p在胆囊癌中的功能及分子机制尚不明确。本研拟采用实时荧光定量PCR试验分析miR-362-3p在胆囊癌中的表达特征，通过细胞功能试验明确其对胆囊癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，并探讨及可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 临床标本

收集本院肝胆外科2009年3月—2011年9月手术切除的44例胆囊癌组织及相应癌旁组织标本（距离肿瘤边缘2 cm外）。所有患者术前均未接受肿瘤放疗和化疗，标本收集后立即放置于液氮保存备用。所有标本均经本院病理科进行病理确诊，临床病理分期采用美国癌症联合委员会的第7版肿瘤淋巴结转移（TNM）分期。患者术后随访72个月，总体生存时间定义为手术到死亡或手术到最后观察时间。本研究已获得该院医学伦理委员会批准，并得到患者和/或其直系家属知情同意。

1.2 相关试剂

胆囊癌细胞系G-415和SGC-996购自中科院上海细胞库。DMEM培养基、胎牛血清（FBS）及双抗购自美国Gibco公司。RNA提取试剂盒、引物、转染试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒均购自美国赛默飞世尔公司。miR-362-3p模拟物和模拟物阴性对照购，NLK过表达载体和阴性对照载体均购自苏州赛业生物科技有限公司。MTT和二甲亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。

1.3 RNA抽提、逆转录反应及qRT-PCR检测

参照TRIzol说明书提取组织RNA，并进行逆转录及实时荧光定量PCR试验。逆转录反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，72 ℃ 10 min，-20 ℃保存。实时荧光定量PCR反应条件为：98 ℃ 10 min，随后98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。人miR-362-3p上游引物：5'-AAC ACA CCT ATT CAA GGA TTC A-3'，下游引物：通用引物；以人U6核内小RNA（U6）为内参，U6上游引物：5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'，下游引物：5'-ACG CTT CAC GAA TTT GCG T-3'。待PCR反应结束后，采用2-ΔΔCt法计算胆囊癌组织及细胞系中miR-362-3p的相对表达情况[16]。

1.4 MTT法

取对数期生长的G-415和SGC-996细胞，并于96孔细胞培养板中进行铺板，使每孔细胞数约为8×103个/孔。将细胞放置培养箱中过夜，待每孔细胞融合度达80%左右时转染miR-362-3p模拟物和模拟物阴性对照。随后，每孔细胞中连续4 d加入15 μL MTT/d（5 mg/mL），放置培养箱孵育4 h并去掉上清，每孔细胞中加入150 μL DMSO溶解结晶，置于常温摇床缓慢摇晃20 min，最后采用测酶标仪测定各孔在450 nm波长时的吸光度（OD值）。

1.5 细胞划痕试验

取对数期生长的G-415和SGC-996细胞，并于6孔细胞培养板中进行铺板，使每孔细胞数约为4×105个/孔。将细胞放置培养箱中过夜，待每孔细胞融合度达80%左右时转染miR-362-3p模拟物和模拟物阴性对照。采用无血清DMEM培养基继续培养细胞6 h，用枪头在每孔细胞中均匀划出4条水平横线，并以37 ℃ PBS洗涤各孔细胞，去除多余杂质及悬浮细胞。随后，采用含FBS的DMEM培养基继续培养细胞，每隔6 h进行拍照，观察和测定各孔细胞划痕宽度。

1.6 Transwell侵袭试验

取转染后的G-415和SGC-996细胞，并于BD Matrigel基质胶/基质膜包被的Transwell小室的上室中进行铺板，使每孔细胞数约为2×104个/孔，随后加入200 μL无血清DMEM培养基；下室加入500 μL DMEM含FBS的DMEM培养基，放置培养箱中培养24 h。随后，擦掉上室中未侵袭的细胞，采用多聚甲醛固定下室细胞，并以吉姆萨染液染色，最后放置显微镜下观察每个视野中侵袭的细胞个数。

1.7 双荧光素酶报告基因试验

取转染后的G-415和SGC-996细胞，并于24孔细胞培养板中进行铺板，使每孔细胞数约为2×104个/孔。将细胞放置培养箱中过夜，待每孔细胞融合度达80%左右时转染miR-362-3p模拟物或模拟物阴性对照和野生型或突变型报告基因载体，并放置培养箱培养48 h。随后，以PBS清洗各孔细胞3次，每孔加入100 μL细胞裂解液，置于常温摇床缓慢摇晃30 min并收集上清液，最后采用Modulus™单管型多功能检测仪测量各孔海肾和萤火虫荧光值。

1.8 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。每组试验至少重复3次，计量资料采用均数±标准差（±s）表示。采用配对t检验比较胆囊癌和癌旁组织中miR-362-3p表达水平，以四格表χ2检验或Fisher确切概率法分析miR-362-3p表达水平与胆囊癌患者临床病理特征的关系，以生存分析Kaplan-Meier法讨论miR-362-3p表达水平与胆囊癌患者预后的关系，其余统计分析采用Student'st或单因素方差分析。P＜0.05视为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-362-3p在胆囊癌和癌旁组织的表达特征

qRT-PCR检测结果显示，miR-362-3p在胆囊癌组织和相应癌旁组织的相对表达量分别为0.47±0.21和1.36±0.45。统计分析发现，miR-362-3p在胆囊癌组织的表达量明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 miR-362-3p在胆囊癌和癌旁组织的表达特征Figure 1 The expression characteristics of miR-362-3p in gallbladder cancer tissues and corresponding adjacent tissues

2.2 miR-362-3p的表达与胆囊癌患者临床病理特征之间的关系

以miR-362-3p表达量平均值（1.36）为界，将44例胆囊癌患者分为低表达miR-362-3p组及高表达miR-362-3p组，其中低表达miR-362-3p组有25例患者，高表达miR-362-3p组有19例患者。低表达miR-362-3p与胆囊癌TNM分期、淋巴结转移及远处转移明显有关（均P＜0.05），而与患者年龄、性别、肿瘤大小及胆囊结石无关（均P＞0.05）（表1）。

表1 miR-362-3p表达与胆囊癌患者临床病理特征之间的关系[n（%）]Table 1 The relations of miR-362-3p expression with clinicopathologic features of patients with gallbladder cancer [n (%)]

2.3 miR-362-3p表达与胆囊癌患者预后的关系

Kaplan-Meier生存曲线显示，低表达miR-362-3p组胆囊癌患者总体生存率较高表达miR-362-3p组患者明显降低（P＜0.05）（图2）。

图2 不同miR-362-3p表达状态与胆囊癌患者的生存曲线Figure 2 The survival curves of gallbladder cancer patients with different miR-362-3p expression statuses

2.4 过表达miR-362-3p对胆囊癌细胞增殖的影响

G-415细胞转染miR-362-3p模拟物和模拟物阴性对照后，细胞中miR-362-3p的相对表达量分别为10.20±3.16和1.0±0.17；SGC-996细胞转染miR-362-3p模拟物和模拟物阴性对照后，细胞中miR-362-3p的相对表达量分别为13.06±2.97和1.0±0.20。统计分析显示，体外转染miR-362-3p模拟物可明显提高G-415和SGC-996细胞中miR-362-3p的表达水平，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图3A）。噻唑蓝比色法显示，体外过表达miR-362-3p可明显抑制G-415和SGC-996细胞增殖（均P＜0.05）（图3B）。

2.5 过表达miR-362-3p对胆囊癌细胞迁移的影响

胆囊癌细胞迁移24 h，G-415细胞转染miR-362-3p模拟物和模拟物阴性对照后细胞迁移距离分别为96.4±26.7和578.3±75.2 µm；SGC-996细胞转染miR-362-3p模拟物和模拟物阴性对照后细胞迁移距离分别为（391.8±51.4）µm和（704.7±95.9）µm。统计学分析显示，过表达miR-362-3p可明显抑制G-415和SGC-996细胞迁移（P＜0.05）（图4）。

图3 过表达miR-362-3p对胆囊癌细胞增殖的影响 A：miR-362-3p相对表达量检测；B：细胞增殖曲线Figure 3 Effect of miR-362-3p overexpression on proliferation of gallbladder carcinoma cells A: Determination of relative miR-362-3p expression levels; B: The cell proliferation curves

图4 过表达miR-362-3p抑制胆囊癌细胞迁移的影响 A：G-415细胞；B：SGC-996细胞Figure 4 Effect of miR-362-3p overexpression on migration of gallbladder carcinoma cells A: G-415 cells; B: SGC-996 cells

2.6 过表达miR-362-3p对胆囊癌细胞侵袭的影响

Transwell侵袭试验如图5所示，G-415细胞转染miR-362-3p模拟物和模拟物阴性对照后细胞侵袭数分别为（101.1±30.9）个和（261.3±47.8）个；SGC-996细胞转染miR-362-3p模拟物和模拟物阴性对照后细胞侵袭数分别为（73.5±22.8）个和（229.6±54.2）个。统计学分析显示，过表达miR-362-3p可明显抑制G-415和SGC-996细胞侵袭（P＜0.05）（图5）。

图5 体外过表达miR-362-3p抑制胆囊癌细胞侵袭 A：G-415细胞；B：SGC-996细胞Figure 5 Effect of miR-362-3p overexpression on invasion of gallbladder carcinoma cells A: G-415 cells; B: SGC-996 cells

2.7 miR-362-3p的靶基因分析结果

采用TargetScanHuman 7.2数据库预测miR-362-3p可能的靶基因，结果发现Nemo样激酶（nemo like kinase，NLK）mRNA 3'-非编码区（UTR）与miR-362-3p存在互补结合位点（图6A）。双荧光素酶报告基因试验发现，miR-362-3p可直接与NLK mRNA 3'-UTR预测位点结合，并降低海肾/萤火虫荧光比值；当人为将上述结合位点突变后，miR-362-3p结合能力消失，相对荧光比值恢复正常（图6B）。

2.8 miR-362-3p模拟物与NLK过表达载体共转染对胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

与共转染miR-362-3p模拟物和阴性对照载体相比，同时转染miR-362-3p模拟物和NLK过表达载体可明显促进细胞增殖、迁移及侵袭（均P＜0.05）（图7）。

图6 miR-362-3p的靶基因分析 A：miR-362-3p与NLK mRNA 3'- UTR结合位点预测示意图；B：双荧光素酶报告基因试验验证miR-362-3p对NLK的直接调控作用Figure 6 Analysis of target gene for miR-362-3p A: The schematic diagram of NLK mRNA 3’-UTR binding site for miR-362-3p;B: Analysis of the directly regulatory effect of miR-362-3p on NLK by dual luciferase reporter gene assay

图7 miR-362-3p模拟物与NLK过表达载体共转染对胆囊癌细胞的影响 A-B：细胞增殖曲线；C：细胞迁移结果；D：细胞侵袭结果Figure 7 Effect of co-transfection of miR-362-3p mimics and NLK overexpression vectors on gallbladder carcinoma cells A–B: Cell proliferation; C: Cell migration; D: Cell invasion

3 讨 论

胆囊癌是一种高致命性疾病，临床预后较差。目前关于胆囊癌发生发展的机分子制尚未完全阐明，因此针对该肿瘤机制的研究显得尤为重要。近年来研究发现，一些miRNA的表达与胆囊癌临床病理特征及预后密切相关，并参与调控肿瘤生长及转移[17]。例如，胆囊癌组织中miR-146b-5p表达下调，其下调水平与肿瘤大小与生长有显著相关性，过表达miR-146b-5p可抑制肿瘤生长[18]。低表达的miR-30a-5p与胆囊癌患者无病生存率和总体生存率呈负相关，体外抑制miR-30a-5p可增加胆囊癌细胞生长及转移[19]。miR-29c-5p在胆囊癌中表达明显下调，并与患者的淋巴结转移、整体生存率和无病生存率相关，过表达miR-29c-5p可显著抑制细胞增殖和转移并增加凋亡[20]。与邻近正常组织相比，胆囊癌组织中miR-133a-3p的表达明显减少，过表达miR-133a-3p显著抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[21]。

前面研究[13-15]报道，miR-362-3p在多种人类肿瘤组织中低表达并发挥抑癌作用，如乳腺癌、宫颈癌及肾癌等。目前关于miR-362-3p在胆囊癌中的表达及功能尚不明确。本研究采用实时荧光定量PCR试验发现，miR-362-3p在胆囊癌组织的表达量显著低于癌旁组织，该结果与miR-362-3p在乳腺癌、宫颈癌及肾癌中表达一致。进一步分析发现，低表达miR-362-3p与胆囊癌TNM分期、淋巴结转移及远处转移密切相关，低表达miR-362-3p组患者总体生存率较高表达miR-362-3p组患者显著降低，因为推测miR-362-3p在胆囊癌中亦发挥抑癌作用。为证实上述科学假说，随后采用噻唑蓝比色法、细胞划痕试验及Transwell侵袭试验观察过表达miR-362-3p对G-415和SGC-996细胞增殖、迁移及侵袭行为的影响。结果发现，体外过表达miR-362-3p可显著抑制胆囊癌细胞的增殖，迁移及侵袭，上述结果表明miR-362-3p在胆囊癌中发挥抑癌功能。

研究表明，miRNA通过碱基互补配对方式与靶基因的3'非翻译区（UTR）结合，进而调控靶基因的表达。为进一步阐明miR-362-3p调控胆囊癌发展发展的分子机制，笔者采用TargetScanHuman 7.2数据库预测其靶基因，发现miR-362-3p可与NLK mRNA 3'-UTR互补结合，提示NLK可能为miR-362-3p靶基因。NLK是一种促生线虫样激酶，亦是Wnt/β-catenin 信号通路一种经典中介，其在癌细胞生长及转移中起重要作用[22]。已有文献报道，NLK在肿瘤中作为一些miRNA的靶基因发挥重要调控作用，包括miR-221[23]、miR-101[24]和miR-92b[25]等。本研究采用双荧光素酶报告基因试验进一步验证miR-362-3p对NLK的直接调控作用，结果发现，miR-362-3p可直接与NLK mRNA 3'-UTR预测位点直接结合，并降低海肾/萤火虫荧光比值；当人为将上述结合位点突变后，miR-362-3p结合能力消失，相对荧光比值恢复正常。更为重要的是，采用功能补救试验发现，过表达NLK可部分逆转miR-362-3p对胆囊癌细胞增殖，迁移及侵袭的抑制作用。上述结果充分证明miR-362-3p通过下调NLK抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

总之，本研究发现miR-362-3p在胆囊癌中表达下调，并与临床病理特征及预后有关。过表达miR-362-3p通过下调NLK抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭，提示miR-362-3p/NLK通路可能作为胆囊癌新的分子治疗靶点。