向敏 胡修忠 程蕾

摘要：为了制定有效的奶牛乳房炎防制措施，从病原菌分离、鉴定、耐药性研究等方面，调查了奶牛乳房炎病原菌的流行病学和耐药性，并研究了奶牛乳房炎的疫苗防控措施。细菌鉴定表明，导致奶牛乳房炎的病原菌主要为葡萄球菌和链球菌，占87.1%（54/62）；其次是各类杆菌占12.9%（8/62）。药敏试验显示多数病原菌对3种以上的乳房炎常用药物具有耐药性。

关键词：奶牛乳房炎；病原菌；耐药性；防控措施

中图分类号：S823.9+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）12-0085-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.12.023

Abstract： In this study，we investigated the epidemic situation and drug resistance of cow mastitis pathogens. The following aspects were contained：isolation，identification and drug sensitive test of pathogenic bactcria of cow mastitis. The results of identification test showed that the mainly pathogen were Staphylococci and Streptococci（87.1%），followed by all kinds of bacillus（12.9%）. The drug sensitivity test showed that most pathogens were resistant to common mastitis drugs.

Key words： cow mastitis； pathogen； tolerance；prevention and control measure

奶牛乳房炎是奶牛的多发病之一，也是奶牛发生较频繁和较昂贵的疾病之一，是影响奶牛业发展的主要疾病之一。据有关文献报道，目前全世界约有2.2亿头奶牛，其中约有1/3的奶牛患有各种类型的乳房炎，每年因乳房炎造成的经济损失超过350亿美元[1]。引起奶牛乳房炎的主要病原微生物为细菌、病毒、支原体和真菌等，以细菌性病原微生物为主。在中国现有奶牛群中，临床乳房炎发病率为9.7%～55.6%，隐性乳房炎阳性率达到61.0%～79.6%[2]。中国奶牛乳房炎的发病率高于世界平均水平，由此造成的不良影响也更严重。有报道称，中国每年由乳房炎导致的奶产量下降的损失达到1 200～3 600元/头以上，占乳房炎总损失的69.0%～80.0%[3]。奶牛乳房炎的发生除因病原微生物感染外，还与各地区气候环境、畜舍环境、管理措施、奶牛自身以及遗传因素有关。中国对该病的研究起步较晚，虽然取得了显著的成绩，但还有许多问题没有解决。另外，国家卫生部门对鲜奶的药物残留有严格的控制标准，而临床用药又极易导致鲜奶中药物残留超标。这导致临床用药受到限制，并且病原菌耐药性增强、抗原变异、血清型复杂等因素，综合导致奶牛乳房炎难以控制。

目前，奶牛乳房炎的防制仍然以加强管理、药物治疗和免疫预防等措施为主。为了使防制措施的效果更加显著，必须对病原的流行病学、耐药性、生物学特性等有较全面的认识。因此，开展奶牛乳房炎的病原分析和防控研究，为该病的防制提供理论依据和数据支持，并为新型防制方法研究提供生物学材料。

1 材料与方法

1.1 奶样

从武汉周边地区奶牛场采集奶样126份。采集奶样前，先用温水清洗乳头及乳房，擦干，弃除头三把奶，用灭菌的7 mL离心管收集约5 mL牛奶，做好标记，立刻置于冰盒中储存，48 h内送至实验室进行病原菌分离。

1.2 培养基及主要试剂

LB琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、TSA培养基和TSB培养基；无支原体新生牛血清购自GIBCO公司；生化鉴定用微量发酵管和药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；PCR试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他试剂为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分离与培养 将无菌采集的样品用接种环直接划线接种于TSA培养基（含5%新生牛血清）和麦康凯琼脂培养基上，37 ℃静置培养12 h。挑取典型菌落，劃线接种于新的TSA培养基。挑取单菌落进行革兰氏染色，初步鉴定细菌特征。如果镜检发现菌落不纯，可再次挑取单菌落划线培养，直至纯化。

1.3.2 病原菌的生化鉴定 将革兰氏阳性球菌接种不同微量发酵罐进行厌氧培养、需氧培养、葡萄糖发酵试验以及触酶试验，若结果均为阳性，拟定为葡萄球菌；以上结果中除触酶试验阴性外，其余为阳性者，拟定为链球菌；革兰氏染色为阴性杆菌，麦康凯平皿上菌落为粉红色、VP试验阴性、脲酶试验阴性、枸橼酸盐试验阴性、MR试验和吲哚试验阳性者为大肠杆菌。

1.3.3 病原菌的PCR鉴定 参考相关文献报道的PCR方法，用特异性的引物对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌进行鉴定。对未区分种属的细菌用16S rDNA通用引物[4]进行扩增，通过测序鉴定细菌的类别。对已鉴定的金黄色葡萄球菌采用荚膜多糖分型引物[5]进行荚膜多糖分型。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌的基因组作为PCR模板，进行基因片段的扩增，并用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，并进行基因测序。试验中设置不加模板的试剂对照。扩增中所使用的引物[6，7]如表1所示。

1.3.4 耐药性试验试验 选取注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素、注射用头孢噻呋钠、注射用盐酸多西环素、注射用氯唑西林钠、硫酸卡那霉素、乳宫无抗（主要成分为鱼腥草）、邦城乳炎专家（主要成分为鱼腥草）、乳痈快克（主要成分为硫酸小檗碱）、鱼腥草注射液、格润常宁（主要成分为穿心莲）11种常用药物的药敏纸片或药液（5 μL），应用琼脂扩散法[8]测定主要病原菌对抗菌药物的敏感性。取各细菌纯培养接种于TSB液体培养基（含5%新生牛血清），37 ℃振荡培育8 h。用无菌棉签吸取适量菌液，在TSA平板表面均匀涂布，然后按一定距离放置各种药敏纸片。37 ℃培养24 h后，用游标卡尺测量抑菌圈的直径，记录结果。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与鉴定

采集的126份奶样中，有62份奶样分离到病原菌，即奶牛乳房炎阳性率为49.2%（62/126）。对分离到的细菌进行革兰氏染色，发现主要为革兰氏阳性球菌，其次为杆菌。生化试验和PCR鉴定结果（图1至图4）显示，引起奶牛乳房炎的病原菌主要是葡萄球菌和链球菌，其中金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和大肠杆菌占到分离细菌的62.9%（39/62）。其他葡萄球菌和链球菌占24.2%（15/62）。另有枯草芽孢杆菌、乳酸乳杆菌和沙门氏菌等，占12.9%（8/62）。金黄色葡萄球菌中带有5型荚膜多糖基因的占72.2%（13/18），带有8型荚膜多糖基因的占11.1%（1/18）。各病原菌的数目及比例统计见表2。

2.2 药敏试验

对各主要病原菌进行药敏试验，结果（表3）表明，不同病菌对药物的药敏性表现出差异。不同牛场分离的同种细菌对同种药物也呈现出不同的敏感性，大部分病原菌能够抵抗3种以上的抗菌药物。金黄色葡萄球菌对部分鱼腥草注射液、穿心莲注射液和硫酸卡那霉素较敏感，对青霉素钠、头孢噻呋钠等药物的抵抗性较强；其他葡萄球菌对硫酸链霉素、穿心莲注射液和部分鱼腥草注射液较敏感，对青霉素和头孢噻呋钠抗性较强；近半数无乳链球菌对硫酸链霉素、盐酸多西环素、氯唑西林钠、鱼腥草注射液和穿心莲注射液较敏感，对其他药物普遍不敏感；其他链球菌对硫酸链霉素、盐酸多西环素、穿心莲注射液和部分鱼腥草注射液较敏感；大肠杆菌对盐酸多西环素、硫酸卡那霉素、穿心莲注射液和部分鱼腥草注射液制剂敏感。

试验结果表明，细菌对青霉素钠和头孢噻呋钠2种常用抗生素表现出了很强的抵抗性，敏感率分别为13.2%（7/53）和22.6%（12/53）。病原菌对乳痈快克的总敏感率只有15.1%（8/53），部分鱼腥草注射液几乎没有抗菌效果。

3 小结与讨论

引起奶牛乳房炎的病原菌种类众多，有细菌、真菌、支原体等[9]，其中主要的病原菌是细菌。本研究对临床采集的患牛乳样进行了细菌分离，结果显示引起乳房炎的病原菌主要为革兰氏阳性球菌，其次是一些肠道杆菌和环境中的杆菌，这与相关报道也是一致的[10]。生化鉴定结合PCR鉴定显示，其中革兰氏阳性球菌多为传染性病原菌，且极易导致乳房炎，这些病菌包括金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌等。其他的机会致病菌为环境中的常在菌，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌等，可通过污水、泥土、空气和粪便等传播。金黄色葡萄球菌和无乳链球菌等乳房炎主要病原菌则主要通过挤奶过程接触传播，如挤奶工的手、污染的毛巾和未彻底消毒的挤奶杯等。因此，规范挤奶操作、保持牛床卫生、及时消毒用具等是预防乳房炎的重要措施。对于已经患乳房炎的奶牛，应及时隔离治疗，避免成为畜舍的传染源。由于尚无可靠的血清型鉴定方法，也没有购买到分型血清，本研究仅对最主要的病原菌金黄色葡萄球菌作了PCR分型，结果表明目前流行的金黄色葡萄球菌主要含5型荚膜多糖基因，这与张倩等[11]报道的结果相似。

不同地区牛场分离的病原菌种类存在一定差异，这可能与牛场的卫生管理措施、操作习惯和地区气候有关系。武汉周边地区采集的乳房炎样本中，金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的分离率最高。其他杆菌中有3株大肠杆菌、2株乳酸杆菌、2株沙门氏菌和1株枯草芽孢杆菌。从病原菌所占的比例来看，流行的主要病原均为金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性球菌。药敏试验结果表明，许多病原菌对抗生素的敏感性较差，这可能与抗生素的滥用有关。研究还发现病原菌对部分厂家生产的某些中药制剂比较敏感，这可能与中药的杀菌成分较复杂有一定的關系[12]，也提示使用中药制剂治疗可能会收到良好的效果。但不同厂家生产的同类中药制剂效果相差很大，有些中药制剂几乎没有什么抑菌效果。研究发现，硫酸卡那霉素抑菌抑菌效果较好，各种病菌对它的敏感率在50.0%～88.9%，这可能与其毒性较大[13]，临床上使用较少有关。病原菌对临床上经常使用的青霉素钠和头孢噻呋钠抵抗性较强，提示这些药物的大量使用会增强病原菌的耐药性。

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