蔡鹤鸣 徐宇虹

【摘要】目的：通过选用3种不同的胚蛋（海兰白父母代、海兰白商品代和京白系，其中海兰白父母代胚蛋为对照品）进行流感病毒接种，观察病毒在三种胚蛋中的培养情况，在海兰白商品代和京白系中选出适合生产用的胚蛋。方法：原液的生产方式按照现行的生产工艺进行生产，比较原液的蛋白含量、血凝素含量、内毒素含量等各项数据。结果：两种实验胚蛋的内毒素含量都低于海兰白父母代，蛋白质含量和血凝素含量都高于海兰白父母代。结论：两种候选胚蛋都适合于生产流感病毒疫苗。

【关键词】流感病毒疫苗；蛋白质；血凝素；内毒素

流行性感冒病毒，简称流感病毒，是有包膜的RNA病毒，属正粘病毒科m主要通过人类谈话时的飞沫、与患有流感的病人的接触或与被流感病毒污染的物品接触而传播。流感病毒包括了人流感病毒和动物流感病毒，而人流感病毒根据病毒核蛋白的抗原性又可以分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三种类型，都是流感的病原体。在流感流行期，无论成人还是儿童，通常咳嗽和发热是患流感的基本特征[2-4]，发热一般在38-40度范围，但可能会更高。

在前面提到的3种类型的病毒中，甲型流感病毒抗原性极其容易发生变异，因此曾引起过多次世界性的大流行.在20世纪时就爆发了三次流感大流行，分别是1918-1919年的西班牙大流感、1957-1958年的亚洲流感以及1968-1969年的香港流感。仅仅1918-1919年的”西班牙大流感”，根据历史记载，当年全世界至少有2500-4000万人死于这次大流行[5]。乙型流感病毒对人类也有比较强的致病性，但是到目前为止还没有发现因乙型流感病毒而引起的大流行；丙型流感病毒到目前为止只引起人类轻微的上呼吸道感染，相对来说也比较稳定，所以也就很少造成流行。由于流感病毒非常容易发生变异，导致流行反复地发生。当出现新毒株，人类免疫水平就会下降，WHO每年也会根据流感病毒的变异规律推荐出用于下一年疫苗生产用流感病毒毒株，因此每年人们都有必要来接种流感疫苗[6-8]。

在我国，目前广泛使用的是流感病毒在鸡胚尿囊腔中生长的方式来制备流感疫苗（组分包含甲1型、甲3型以及乙型病毒的三价裂解疫苗）。所以，生产中使用的鸡胚质量如何，是否能达到各项要求就显得十分的重要了。本人所在的公司流感疫苗生产所用胚蛋为海兰白父母代，而近些年由于禽流感疫情经常发生，所以从2013年开始国内海关禁止从国外引进活禽，何时解除禁令不得而知，2017年本公司流感疫苗生产用海兰白父母代鸡胚蛋将无货供应，同时国内的公司这几年来通过不断的努力也研发培育出了不错的种鸡和胚蛋，所以一方面为了降低禽流感的风险，同时也为了扩大本公司流感疫苗生产用胚蛋品种的选择范围，2016年对海兰白商品代和京白系胚蛋进行了试验，海蘭白父母代胚蛋作为对照。经生产部、质保部开会讨论，选择2016年生产的3批甲1型、2批甲3型、2批乙型单价病毒原液（共7批）进行变更验证，3种胚蛋每批原液生产时各投入约2.5万枚进行生产。生产过程中，试验蛋与对照蛋严格分开，分别完成原液各生产步骤，独立形成单价原液，对生产工艺各阶段与胚蛋质量及产品得率相关的数据进行统计和比对。

1 材料与方法

1.1 鸡胚

原液制备使用的10日龄鸡胚由宁波威达龙禽业有限公司提供，由上海家禽育种有限公司孵化。

1.2 病毒

3个流行性感冒病毒毒株A/California/7/2009（甲1型）、A/Hongkong/4801/2014（甲3型）、B/Brisbane/60/2008（乙型），由英国国家生物制品检定所（NIBSC）提供。

1.3 设备及仪器

TKA自动胚蛋接种机、TKA自动尿囊液收获机、Millipore超滤系统、MettlerToledo DM40密度计、日立CP80WX超速离心机、金达HD-93-1核酸蛋白检测仪、Beckman J6离心机。

1.4 接种

用含有最终浓度为500 9g/ml硫酸庆大霉素的0.01mol/L的PBS溶液稀释毒种。将胚蛋放到接种机上，每胚接种病毒。接种了病毒的胚蛋置孵，房孵育50-60小时。

1.5 收获

用检蛋器检查已经孵育到期的胚蛋，去除死胚、鸡胚生长不良、胚蛋污染等不合格的胚蛋。然后将合格的胚蛋移入冷库冷却。冷却到期后将胚蛋放置于收获机上，收获尿囊液的同时检查是否有不合格胚蛋，收获合格胚蛋的尿囊液。

1.6 浓缩

通过Millipore超滤系统对收获尿囊液进行浓缩，浓缩后的尿囊液通过MilliporePellicon-2超滤系统进一步浓缩，然后加入PB溶液后继续浓缩并回收。最后回收的浓缩尿囊液量控制在原收获尿囊液液量的1/30至1/40。

1.7 纯化

量取浓缩后的尿囊液并倒入烧杯内，通过蠕动泵把样品导入区带转头。同样的方法依次导入30-33_%w/w飞蔗糖溶液、55-56_%w/w蔗糖溶液，当转头中心孔硅胶管流出样品时，停止导入55-56%诀几蔗糖溶液。量取0.125 mol/L的PB溶液，通过蠕动泵把PB溶液从中心孔导入区带转头内。设定离心速度开始离心。离心结束后收集病毒液。

1.8 裂解及灭活

用0.25_mol/L的PB溶液回收稀释，使裂解前病毒液蛋白质含量在600-900_μg/ml范围内。将病毒液导入裂解罐，加入10_%w/v，聚山梨酯80溶液，搅拌。加入与裂解前病毒液等量的乙醚，搅拌。将病毒裂解液分装于离心瓶中并离心。离心好之后加入4甲醛，使其最终浓度为80_μg/ml。于2-8℃放置18小时。

1.9 裂解液纯化

按照1.7的方法对病毒裂解液进行区带离心，离心结束后收集病毒液。

1.10 透析脱糖

用0.01_mol/L的PBS溶液10倍稀释病毒液。通过超滤膜包透析去除蔗糖，10倍浓缩后结束第一次透析。再次用0.01_mol/L的PBs溶液10倍稀释，进行第二次透析。

1.11 除菌过滤

压滤桶内倒入一定量0.01_mol/L的PBS溶液，使PBS溶液依次通过澄清过滤滤膜和除菌滤膜。将待滤样品倒入压滤桶，使样品依次通过澄清过滤滤膜和除菌滤膜。等待滤样品过滤完后，在压滤桶内倒入适量0.01_mol/L的PBS溶液清洗滤膜，清洗液体和之前的病毒液都通过滤膜收集在收液瓶内，并加入已除菌过滤的4_%w/v甲醛溶液。

2 结果

数据汇总（数据为平均值）见表1。

3 讨论

本次胚蛋变更验证试验，每批试生产同时投入三种胚蛋进行平行比对，三种胚蛋来源均符合企标要求，使用的流感毒种一致，生产过程使用的原辅材料均一致。病毒接种、收获、浓缩工段使用同一套设备，所以在生产时间上进行了分割，前一种胚蛋相关生产清场后，再开始后一种胚蛋的相关生产。纯化和裂解液纯化两个工段所使用的部分离心机都是相同型号的离心机。综上，我们认为三种胚蛋所对应的原液数据是客观的。

对比表1数据，在10日龄尿囊液量、胚蛋合格率、原液得率、原液血凝素含量、原液蛋白质含量的数据中海兰白商品代的数据是最高的，京白系胚蛋在胚蛋合格率、原液得率、原液血凝素含量、原液蛋白质含量上高于海兰白父母代（對照品），三者的内毒素含量也无太大差异，因此，我们认为两种候选胚蛋（海兰白商品代、京白系）都可以用于2017年的流感病毒疫苗生产。

参考文献

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