马 雪，孙淑文，李 杨，孙燕飞，雷勇辉

（1.石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003，2.石河子大学农学院，新疆 石河子 832003）

新疆地处我国西北边疆（73～96°N、34～48°E），地理位置特殊，地质地貌多样，整体气候干旱少雨，微生物资源特殊［1］。酵母菌在自然环境中分布较为广泛，湖泊和海洋酵母菌也日益受到关注与研究［2］，西藏拉鲁的湿地土壤［3］、云南程海湖泊［4］、酿造白酒的大曲［5］、南极德雷克海峡表层海水［6］中都有发现酵母菌分布。新疆独特的气候造成不同地区酵母菌的多样性差异。研究发现，新疆酿酒酵母菌群结构特征明显受到多变的地域气候、种植的葡萄品种等多重影响［7］。月季（Rosa chinensisJacq.）属蔷薇科，在我国已有悠久的栽培历史［8］。月季花繁叶茂、香味浓郁，被誉为“花中皇后”［9］，其提取物或某些成分在抗氧化、抗衰老等方面具有较好的生物活性及药理作用［10］。通过空气传播和（或）传粉者的喙接触花蜜及花冠［11］，一般每一花蜜样品中平均含1～2种酵母菌［12］；在蜂的口器及消化道中分离出的花蜜微生物能加工多肽、多糖等［13］，可见研究花蜜微生物可以更好地了解植物-微生物-传粉者间的作用关系［11］。目前对新疆花卉中酵母菌的研究报道较为罕见。因此本试验利用26S rDNA高通量测序技术及可培养酵母菌的分离纯化鉴定，对石河子月季花中酵母菌物种多样性进行全面研究，明确月季花上主要酵母种类及其门属分布特点。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017年9月初到10月底在石河子公园采用五点取样法采摘开花期月季若干，将花瓣样品装入灭菌信封，放入冰盒，带回石河子大学实验室，放入4℃冰箱中保存备用。

供试培养基YPD液体培养基、PDA培养基、YM培养基参照文献［14］制备，糖类发酵培养基、碳源同化基础培养基、缺维生素培养基、尿素琼脂参照文献［15］制备。

试验主要仪器与设备包括ZHWY-100B 摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）、HWS恒温恒湿培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、Applied Biosystems ProFleX PCR System仪器（Life Technologies公司）、Eppendorf 5424R高速冷冻离心机、SW-CJ-1F 超净工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 月季附生酵母菌群（可培养和不可培养）的高通量测序分析 将月季花瓣与无菌水按1∶2比例置于锥形瓶中，3个重复，摇床24 h后将花瓣在无菌条件下过滤，滤液用0.45 μm的滤膜进行抽滤，对抽滤后的滤膜提取DNA，送样至上海派森诺生物科技有限公司，对样品26S rDNA D1/D2区进行高通量测序，测序引物为NL-1和NL-2，引物序列分别为5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和5′-CTTGTTCGCTATCGGTCTC-3′。利用Illumina(MiSeq)平台，对获得的序列进行可操作分类单元（Operational Taxonomic Unit，OTU）归并划分，每个OTU的代表序列用于分类地位鉴定，在属水平对菌群进行聚类分析，根据聚类结果分析月季中酵母菌群落丰富度的差异。

1.2.2 α多样性分析 对新疆石河子地区月季高通量测序结果进行α多样性的相关分析，在97%分类水平上，采用QIIME（1.8.0版）软件计算样品的丰富度和多样性指数。多样性指数包括Chao1丰富度估计指数、ACE丰富度估计指数、Shannon多样性指数、Simpson 多样性指数。

1.2.3 可培养酵母菌菌株分离与保藏 为较全面地获得月季花上的附生酵母菌，采用稀释涂布法和孢子弹射法进行酵母菌的分离培养［14］，两种方法分别做3个重复。

稀释涂布法：按照1.2.1中相同的步骤，在无菌条件下将抽滤后的滤膜放入锥形瓶中，加入100 mL无菌水稀释混匀，吸取100 μL涂布于PDA平板，28℃恒温培养48～72 h后，挑选单个菌落并制作水浸装片，在显微镜下初步观察，将初步确认为酵母菌的单菌落在PDA平板上进行无菌操作，划线纯化2～3次，获得纯培养物。孢子弹射法：将月季花瓣贴于PDA固体培养基的培养皿盖内，让酵母菌的孢子弹射在培养基上生长，然后挑取单菌落按照相同的操作步骤进行纯培养。纯化菌株采用PDA斜面和干粉冷冻保藏［16-17］。

1.2.4 可培养酵母菌生理生化检测及系统发育分析 根据酵母菌分类学的标准研究方法，对菌株进行菌落形态、细胞显微形态分析及生理生化鉴定［9,13］。将获得的酵母细胞接种在5 mL YPD液体培养基中，28℃培养过夜，离心收集细胞，用CTAB法提取DNA后进行26S rDNA基因的PCR扩增。PCR扩增体系（25μL）：DNA 1 μL、Taq聚合酶（5 U/ L）1 μL 、10×TaqE buffer 2.5 μL、dd H2O 15 μL 、25 mmol/L MgCl21.5 μL、d NTP（2.5 mmol/L）2 μL。PCR反应程序为95℃1 min；95℃10 s、60℃20 s、72℃ 40 s，35 个循环［16］。26S rDNA基因的扩增引物为NL-1和 NL-4。NL-1引 物 序 列 同 1.2.1，NL-4为5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。扩增产物经1%琼脂糖凝胶上电泳检测后送上海生物工程有限公司进行测序。采用DNAStar软件对酵母菌的26S rDNA D1/D2序列进行分析，登录NCBI网站进行BLAST序列比对，下载相关序列，通过MEGA7.0软件中的邻接法构建系统进化发育树，参照文献［15］进行系统进化分析。

2 结果与分析

2.1 高通量测序结果与群落结构组成分析

将月季花样品中提取的DNA进行MiSeq高通量测序并优化后，共获得41 337条高质量且有效的序列，通过OTU聚类分析得到3 078个OTU，酵母菌群落进一步优化分类得到鉴定结果为3个门、10个纲、13个目、22个科、37个属、90个种。

门水平上，担子菌门（Basidiomycota）为优势门、占18.9%，子囊菌门（Ascomycota）占1.3%；属水平上，OTU分类鉴定结果为37个酵母菌属，为掷孢酵母属（Sporobolomyces）、南极假丝酵母属（Pseudozyma）、红酵母属（Rhodotorula）、毕赤酵母属（Pichia）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、梅奇酵母属（Metschnikowia）、棒孢酵母属（Clavispora）、隐球酵母属（Cryptococcus）、克氏担孢酵母属（Kurtzmanomyces）、丝孢酵母属（Trichosporon）、接合酵母属（Zygosaccharomyces）、威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）、拟威克酵母属(Wickerhamiella)、假丝酵母属（Candida）、线黑粉菌属（Filobasidium）、Cystof i lobasidium、Udeniomyces、Tremella、Papiliotrema、Kwoniella、Tetrapisispora、Prototheca、Holtermannia、Yamadazyma、Trimorphomyces、Curvibasidium、Itersonilia、Malassezia、Moniliella、Hyphopichia、Cyniclomyces、Komagataella、Geotrichum、Lachancea、Hanseniaspora、Bannoa、Mrakia，反映月季花中附生酵母菌群落多样性丰富。

聚类分析结果显示，在可鉴定的菌群中，属水平上酵母菌群共占20.2%（图1），优势酵母菌属为线黑粉菌属（Filobasidium）、占12.2%，其次为Udeniomyces、占3.3%，Cystof i lobasidium占1.6%，其他属占0.1%～0.7%不等，表明月季附生酵母菌群落丰富度差异较大。

2.2 α多样性分析

α多样性分析常用的度量指数主要包括侧重于体现群落丰富度的Chao1指数和ACE指数，以及兼顾群落均匀度的Shannon指数和Simpson指数，利用QIIME（1.8.0版）软件计算结果为 Chao1指 数 623.00，ACE指 数 623.00， 表明OTU数目较多，月季花中微生物群落丰富度很大；Simpson指数0.94，Shannon指数5.68，Simpson指数与其他多样性指数均呈负相关，Shannon指数呈正相关，说明月季花中微生物群落多样性较高。

2.3 可培养酵母菌生理生化检测及系统发育分析

图1 属水平上酵母菌群丰度值

表1 酵母菌形态学观察及形态特征

经形态学鉴定（图2，封二、表1），4个菌落形态都为圆形，Y1b-1颜色为奶白且双端芽殖，其余3个菌落细胞都为单端芽殖，Y1b-2和Y1c-1颜色都为乳白，Y1c颜色为淡粉，从形态学鉴定可初步估计Y1b-2和Y1c-1为同一属。对采用26S rDNA D1/D2区域测序，利用MAGA7.0构建系统发育树，对所分离的4株酵母菌进行系统分类鉴定，系统发育树结果（图3）显示，4种菌株与各自的模式菌株聚在一枝，表明系统发育树的聚类结果与26S rDNA D1/D2区碱基序列的同源率鉴定结果（在GenBank数据库中进行同源序列搜索BLAST后，4株酵母菌与最近缘种的模式菌株相似率都为99%）一致；且相同属的菌株归于同一分枝，具有较近的亲缘关系，而不同属则相距较远。结果显示分离菌株属于毕赤酵母属（Pichia）、红酵母属（Rhodotorula）、隐球酵母属（Cryptococcus）3个属，优势酵母属为隐球酵母属（Cryptococcus）；结合生理生化实验结果（表2、表3）分析，4个菌株的发酵糖类实验、同化碳源实验等生理生化实验结果参照文献［15］确定酵母菌种，Y1b-1为毕赤酵母属（Pichia）季也蒙毕赤酵母（Meyerozymaguilliermondii）、Y1c为红酵母属（Rhodotorula）粘性红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、Y1b-2为隐球酵母属（Cryptococcus）乌兹别克斯坦隐球酵母（Cryptococcusuzbekistanensis）、Y1c-1为隐球酵母属（Cryptococcus）浅白隐球酵母（Cryptococcus albidus）。

图2 酵母菌菌落形态及细胞形态

图3 基于酵母26S rDNA D1/D2 区序列构建的新疆石河子地区月季花酵母菌系统发育树

表2 酵母菌糖发酵鉴定及相关生理生化指标鉴定结果

表3 酵母菌碳源同化实验结果

3 结论与讨论

本研究结果表明，新疆石河子月季花附生酵母菌群落结构丰富，鉴定划分为3个门、10个纲、13个目、22个科、37个属、90个种；担子菌门（Basidiomycota）为优势门、占18.9%，线黑粉菌属（Filobasidium）为优势属、占12.2%；可培养的酵母菌鉴定为季也蒙毕赤酵母（Meyerozymaguilliermondii）、粘性红酵母（Rhodotorulamucilaginosa）、乌兹别克斯坦隐球酵母（Cryptococcusuzbekistanensis）、浅白隐球酵母（Cryptococcusalbidus），属于毕赤酵母属（Pichia）、红酵母属（Rhodotorula）、隐球酵母属(Cryptococcus) 3属4种，优势酵母属为隐球酵母属(Cryptococcus)。通过新疆石河子月季花酵母多样性的研究，探明了新疆月季花酵母菌种群的分布特征，为潜在的酵母菌资源利用提供数据，并为探索花蜜微生物与植物相互作用提供理论依据。

本研究利用26S rDNA D1/D2区域序列的高通量测序，分析新疆石河子地区月季花附生酵母菌，由于引物NL1和NL4是酵母菌测序的通用引物，但高通量测序时片段过大，故本研究采用引物NL1和NL2，OTU分类鉴定结果为属水平上划分到37个酵母菌属，占比超过20%，基本能反映月季花中酵母菌群落结构。此外还鉴定到其他微生物菌群，有枝孢属（Cladosporium）、拟南芥属（Arabidopsis）、小球腔菌属（Leptosphaeria）等，因此本试验所用的引物还有一些局限性，需要进一步研究改进。

可培养酵母菌仅分离鉴定获得4株酵母菌株，与高通量测序结果相比，表现为菌株多样性偏低。研究表明花蜜所含的抗菌化合物等［18］可能会限制花蜜中的微生物种类及其群落构成［11］，对月季花冠也会带来影响。而石河子地区的早晚温差大，气候相对干燥，对酵母菌的生长会有影响，已有研究证明酵母菌的发生率、密度及多样性受地区因素极大［11］；另外，本试验在培养分离酵母菌时用的培养基种类、培养温度、培养环境等条件对于研究酵母菌的生长还存在局限，使可培养获得的酵母菌株多样性较少，对于本地区月季花上酵母菌的多样性培养条件还有待进一步改进。

从高通量测序聚类结果来看，担子菌门（Basidiomycota）为优势门占18.9%，子囊菌门（Ascomycota）占1.3%。子囊菌门的酵母菌通常易出现在蔗糖主导的花蜜中［19］，而低浓度的己糖主导花蜜则利于担子菌门酵母菌在此种花蜜中的孕育［11］，这可能与月季花的花蜜浓度低有关，使得花冠的酵母菌也以担子菌门为主，其中担子菌门有9属：隐球酵母属（Cryptococcus）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）、线黑粉菌属（Filobasidium）、Udeniomyces、Cystofilobasidium、Tremella、Papiliotrema、Kwoniella、Holtermannia；其余7属为子囊菌门：假丝酵母属（C a n d i d a）、毕赤酵母属（Pichia）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyce）、接合酵母属（Zygosaccharomyces）、拟威克酵母属（Wickerhamiella）、Tetrapisispora、Prototheca，可培养分离得到的酵母菌担子菌门有2属，为红酵母属（Rhodotorula）、隐球酵母属(Cryptococcus)，子囊菌门仅1属，即毕赤酵母属（Pichia），这与Pozo等［20］的研究结果一致，表明子囊菌门的假丝酵母属（Candida）与担子菌门的红酵母属（Rhodotorula）、隐球酵母属(Cryptococcus)及掷孢酵母属（Sporobolomyces）酵母菌在植物花蜜中常常出现，但发生率相对较低［11］。本研究结果显示，石河子月季中，担子菌门（Basidiomycota）的酵母菌物种多样性更为丰富，这可能与担子菌门对环境的适应能力更强有关。由于新疆地理环境特殊，严酷的生境及昼夜温差利于糖分积累的条件可能有利于担子菌门酵母在月季花上的进化及生长。