陈杰 马世蓉 刘汉儒 张迎春 曾忠良

摘要：文章通过建立可同时测定中药复方注射液回阳液中人参皂苷Rbl、Rgl、Re含量的高效液相色谱方法，以便为建立HYY的质量标准提供依据。采用的方法是Agilent Zorbax SB-Cl8柱（4.6 mm×150 mm，5μm），以乙腈一水为流动相进行梯度洗脱，流速1.0 m L/min，柱温25℃，检测波长203 nm。实验结果显示在本色谱条件下，人参皂苷Rbl、Rg1、Re分离度良好，系统适应性实验表明3种成分的检测其线性关系良好（R2Rg1=0.999 2；R2Rb.=0.999 1；R2Re=0.999 5）；其精密度、重复性、稳定性良好；人参皂苷Rb1、Re、Rg1的平均加样回收率分别为97.5g%，101.32%和98.87%（RSD值分别为2.12%，1.77%，2.2g%），符合要求。实验结果表明，建立的HPLC分析检测方法可以用作复方中药HYY的质量控制。

关键词：回阳液；反相高效液相色谱；人参皂苷；多组分测定

1 HYY概述

中药复方回阳液（Huiyang Ye，HYY）是西南大学药学院中药教研室自制，由人参、麦冬、甘草等味中药组成。该制剂是基于临床应用，源于参附汤基础上创制的主要用于临床急救的新药剂。药效学实验确证该复方制剂HYY具有益气养阴，回阳救逆，复脉固脱的功效，可用于治疗因过劳、久泻、大失血、败血性感染疾病等表现的脉微欲绝、四肢厥逆、神志不清等症候，对临床表现的心衰、血压过低或休克病理过程也具有良好的急救疗效。

药物以其安全性、有效性、稳定性及质量可控性决定了药物本身的价值。尽管中药，尤其是复方制剂的化学成分复杂，甚至有未知不确定性成分的存在，通常很难用质量检测手段对其质量进行全面检测。但对其主要药效组成中药的标志性有效成分的质量控制及其标准的研究，不仅可规范药物制剂的生产管理，同时，也是保障药物有效性和安全性的基本保证。

就中药复方HYY来说，其君药组成为人参（生晒参）。其所含有的人参皂苷是人参的主要活性成分，且人参价高。为了保汪制剂的质量，强化生产过程的规范管理，保障制剂的有效性和安全性，有必要对其制剂中所含标志性成分人参皂苷Rb1、Re、Rg1的含量进行管控。因此，开展本实验，采用反相HPLC法检测中药复方注射液HYY中3种主要有代表性的皂苷Rb1、Re、Rg1的含量及控制标准的研究，可为该新制剂质量标准的建立奠定基础，为新制剂的申报注册提供依据。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验仪器

日本岛津高效液相色谱仪LC-20A岛津液相色谱仪配有SPD-20A检测器、LC-20AB泵、CTO-IOASvp柱温箱、SHIM UV-2550紫外分光光度计；美国C18柱PLATISILTMODS（5μm，4.6×150 mm）；瑞士梅特勒公司电子分析天平AE240；重庆前沿水处理设备有限公司超纯水仪QYSW-20A；昆山市超声波仪器厂超声波清洗仪KQ-250；上海齐欣科学仪器有限公司真空干燥箱DHP-9052。

2.1.2 实验试剂

对照品人参皂苷Rbl、Re、Rgl均由中国食品药品检定研究院提供；甲醇、乙腈为色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水；其余试剂为分析纯，市售；人参药材购于重庆北碚和平大药房；中药复方回阳液（HYY）样品（共10批）由西南大学药学院中药室自制。

2.2 色谱条件

固定相：C18柱PLATISILTM ODS （5μm.4.6×150 mm）。

流动相A：水；B：乙腈。

梯度洗脫过程（v/v）：

0-25 min A： 81% B：19%

25-40 min A：

81%→63% B：19%→37%

40-45 min A： 63%→81% B：37%→19%

45-55 min A： 71%→60% B：19%

检测波长：203 mn；流速：1.0 mL/min；柱温25℃；进样量10μL

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备

精密称量人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品5 mg，加甲醇25mL制成质量浓度0.2 mg/mL的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备

精密量取中药复方HYY10 mL或者相同来源的人参药材提取液，真空干燥箱挥干溶剂后加甲醇适量，超声15min，离心，取上清液转移至25 mL容量瓶中，加甲醇定容。

2.4 系统适应性实验

2.4.1 线性关系的考察

精密吸取1.3.1配置好的人参皂苷Rb1、Rg1、Re混合标准品溶液5mL，按比例稀释为6份不同浓度的人参皂苷混合标准品溶液。1.2项下的色谱条件进样。以峰面积为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，绘制各自的标准曲线。

2.4.2 精密度实验

同一供试品溶液，按照1.2项下条件重复进样6次。

2.4.3 重复性实验

分别取同一批次的人参（生晒参）提取液及中药复方HYY各6份，每份5mL，依1.3.2项下的方法制备供试品溶液，并在1.2项下色谱条件进样。

2.4.4 稳定性实验

制备好的供试品溶液，常温放置，分别于Oh，6h，12 h，24h，36h，48h在1.2项下色谱条件进样。

2.4.5 加样回收实验

取己测含量的供试品溶液9份，每份6 mL，分成3组，每组分别加入人参皂苷标准品溶液0.5 mL，1mL，2 mL，加甲醇定容到10 mL。1.3.2制备方法处理样品后，按照2.2.1的色谱条件进行含量的测定。

2.5 样品测定

10批次HYY分别按1.3.2项下方法平行制备供试品溶液各2份，共计20份样品。按1.2项下条件进样分析。测定3种人参皂苷的色谱峰面积，并计算其含量。

3 结果与分析

3.1 HPLC图谱

在拟定的色谱条件下，3种人参皂苷分离度良好，如图1～3所示。

3.2回归方程的确定

经计算，3种人参皂苷Rgl、Rbl、Re回归方程分别是：

Yi=283 28ICI-27 497 （R2=0.999 2）

Y2=197 807C2-13 003 （R2=0.999 1）

Y2=327 512C3+119 485 （R2=0.999 5）

線性范围分别是3.34-167μg/mL 4.58-229μg/mL3.66-183μg/mL。结果表明，此色谱条件下，峰面积与含量之间存在良好的线性关系。

3.3精密度实验

HYY供试品溶液中人参皂苷Rb1、人参皂苷Re及人参皂苷Rg1峰面积的RSD分别为2.02%，1.510/和1.83%。此结果说明此分析仪器的精密度良好。

3.4 重复性实验

同一批HYY供试品溶液中人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rbl峰面积的RSD分别是1.08%，0.9 8%，1.30%。结果表明，本实验建立的方法重复性良好。

3.5 稳定性实验

HYY供试品溶液中3种人参皂苷峰面积的RSD值分别是2.68%，1.9 3%，2.37%。表明回阳液供试品溶液在48 h内稳定性好。

3.6 加样回收试验

计算得到人参皂苷Rb1，Re，Rg1的平均加样回收率分别为97.5g%，101.32%和98.87%，其RSD值分别为2.12%，1.77%，2.2g%。结果表明，此实验方法加样回收率良好，符合高效液相色谱的要求。

3.7 供试品溶液中3种人参皂苷的含量

供试品溶液中3种人参皂苷的含量如表1所示。

4 实验结果

10批回阳液中人参皂苷含测结果显示，人参皂苷Rb1、Rg1、Re的含量分别是（5.19±0.29μg/mL），（7.00±0.31μg/mL），（3.10±0.33μg/mL），其95%的可信限分别是4.80-6.39，7.79-8.27，2.16-3.48。3种人参皂苷的总量是（16.52±1.34μg/mL），其95%的可信区间是14.86-18.18。由此，可以此建立回阳液最低含量限量的质控标准。

人参皂苷具有抗氧化、增强免疫、强心升压、改善心肌代谢、调血脂的作用，对心脑血管系统有良好的保护作用，这些功效与制剂功效吻合。实验结果表明，中药复方HYY中人参皂苷Rg1的含量最高，其次是Rb1，Rg1含量较少，这与组方中药选用生晒参有关，与相关文献的报道也基本一致。

人参皂苷Rgl和Re同属于20 （s） -原人参三醇类，结构、性质相近，在C18色谱柱中是最难分离的物质对之一。本实验通过查阅文献，筛选了大量HPLC法测人参皂苷的方法。通过筛选和对比，本实验最终建立了这种反相高效液相色谱法。该方法出峰时间短、峰形好、3种皂苷成分分离度大，具有简便、快速、准确，重复性好等优点，可操作性强，可以为中药复方HYY质量控制提供行之有效的参考方法。