周家伟 刘雨佳 胡添源 张逸风 高伟 黄璐琦

摘要 目的：单加氧酶（Monooxygenase，MO）是一类通过在底物上加一个氧原子的加氧酶，在动植物体内参与多种代谢途径。本实验致力于从雷公藤转录组数据中克隆得到单加氧酶基因cDNA全长，并对克隆得到的MO基因进行初步的功能分析。方法：通过对雷公藤转录组数据中筛选得到MO基因片段设计特异性引物，克隆MO基因cDNA全长，通过生物信息学方法对得到的MO基因进行分析，主要包括多重序列比对，蛋白结构预测和构建进化树分析等。结果：根据分析结果TwMO基因全长为2 193 bp，共编码507个氨基酸，等电点为8.84，相对分子质量为55.20 kDa，多重序列比对显示它与其他植物的MO基因具有较高的同源性。雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后，实时荧光定量结果显示，TwMO的表达量明显增加，并在48 h达到最高，提示TwMO基因与雷公藤的次生代谢产物的生成有关。结论：本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到MO基因，为进一步研究该基因的功能奠定基础。

关键词 雷公藤；克隆；基因；单加氧酶；表达分析

Abstract Objective：Monooxygenase （MO） is a kind of enzymes that can incorporate one atom of oxygen into the substrates in many metabolic pathways.This study aimed to clone the full-length cDNA of a MO from the transcriptome data of Tripterygium wilfordii and analyze its function.Methods：The full-length cDNA of monooxygenase （TwMO） was cloned from the transcriptome data of Tripterygium wilfordii by designing specific primers.The TwMO gene was then analyzed by a series of bioinformatics analysis.Results：It showed that the full length of TwMO cDNA was 2193 bp encoding 507 amino acids.The theoretical isoelectric point was 8.84 and the molecular weight was about 55.20 kDa.Sequence alignment and phylogenetic analysis demonstrated that TwMO had relative close relationship to MO from other species of plants.The relative expression level of TwMO after MeJA inducing was up-regulated and highest at 48 h，which suggested its regulatory role in special metabolites biosynthesis.Conclusion：This work laid the foundation for further studying the function of this monooxygenase in Tripterygium wilfordii.

Key Words Tripterygium wilfordii； Clone； Gene； Monooxygenase； Expression analysis

中圖分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.005

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）为卫矛科（Celastraceae）雷公藤属植物，其干燥根或根的木质部作为中药雷公藤使用。中药雷公藤在我国具有悠久的用药历史[1]，其具有祛风除湿、通络止痛、解毒杀虫、消肿散结等功效[2]。雷公藤中的活性成分主要分为萜类和生物碱类，现代药理研究表明雷公藤中的有效成分如雷公藤甲素和雷公藤红素等具有抗肿瘤[3]，抗炎抗风湿[4]和神经营养活性[5]等作用，另有研究报道雷公藤红素可以使正常肥胖小鼠体质量下降45%，从而达到减肥的作用[6]。雷公藤红素和雷公藤甲素与青蒿素、辣椒素和姜黄素被列为最有可能被开发成为现代药物的5种传统天然药用化合物[7]。

加氧酶属于氧化还原酶类，可以分为双加氧酶和单加氧酶。单加氧酶也称作羟化酶或羟氧酶，可以使底物和一个氧原子结合，而另一氧原子在氢供体（NADPH等）的作用下生成水[8]。细胞色素P450属于单加氧酶中的一类，它参与多种体内代谢过程，与药物和毒物的代谢密切关系。此外，P450家族基因对中药中的活性成分的合成起着关键的作用，参与多种中药活性成分的生物合成过程[9-10]。鲨烯环氧化酶也属于单加氧酶，它是三萜和甾醇生物合成上的关键酶基因，它的活性和功能影响着三萜和甾醇的生物合成。鲨烯在鲨烯环氧化酶和其辅酶细胞色素P450还原酶（Cytochrome P450 Reductase，CPR）的作用下生成环氧鲨烯[11]，环氧鲨烯再进一步转化为三萜或甾醇类物质。在植物中，鲨烯环氧化酶通过影响植物的甾醇和三萜类活性成分的合成进一步影响植物的生长和发育以及应对生物和非生物的压力。研究表明在拟南芥中发现的环氧鲨烯酶SE1基因影响着拟南芥的根和种子的发育而SE3基因影响胚芽的发育和大小[12-13]。

鉴于单加氧酶对药用植物的生长发育和中药活性成分生物合成的重要性，本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到一条MO基因，该基因全长2193 bp，具有完整的开放阅读框，共编码507个氨基酸。通过生物信息学分析，初步分析了该基因编码蛋白的生物学功能。此外，本文研究了TwMO基因在茉莉酸甲酯诱导下的表达方式，为进一步研究TwMO基因在雷公藤中的作用奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 2-16K型低温冷冻离心机（Sigma公司），MM400型混合型球磨仪（Retsch公司），VeritiTM 96孔梯度PCR仪（ABI公司），GBOXHR型紫外凝膠成像分析仪（Syngene公司），QuantStudio 5 Real-Time PCR System（ABI公司）等。

1.2 试剂 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Thermo公司生产），Fast Quant cDNA第一链合成试剂盒、快速小提质粒试剂盒和RNA纯化试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司生产），Easy taq酶（北京全式金生物技术公司生产），Eastep Super总RNA提取试剂盒（上海普洛麦格生物产品有限公司生产），PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（宝生物工程（大连）有限公司生产），2xPhusion HF PCR Master Mix（NEB公司生产），KAPA SYBR FAST qPCR Kit MasterMix（2X）Universal试剂盒（Kapa biosystems公司生产）。菌株和质粒：Trans1-T1感受态细胞、pEASY-Blunt Zero vector（北京全式金生物技术有限公司生产）。

1.3 分析样品 雷公藤悬浮细胞由本实验室继代保存[14]。

2 方法与结果

2.1 雷公藤总RNA的提取和精制 将雷公藤悬浮细胞加入茉莉酸甲酯（MeJA）诱导（终浓度为50 μM），分别于诱导后12、24、48 h取材，液氮速冻后存于-80 ℃冰箱。取各诱导时间点雷公藤悬浮细胞0.4～0.6 g，液氮环境下研磨粉碎。采用Eastep Super总RNA提取试剂盒提取3个时间点悬浮细胞的总RNA，用RNA纯化试剂盒对提取的总RNA进行精制。通过凝胶电泳检测RNA的质量。

2.2 TwMO cDNA全长克隆 cDNA第一链以精制后的总RNA为模板，通过SMARTerTM Race cDNA，Amplification Kit试剂盒反转录后得到。根据雷公藤转录组数据注释，筛选出MO基因片段，对MO基因片段设计特异性扩增引物。见表1。以获得的cDNA第一链为模板，在VeritiTM 96孔梯度PCR仪上进行全长扩增。50 μL的反应体系：1 μL模板DNA、25 μL的2xPhusion HF PCR Master Mix、2.5 μL的正向引物、2.5 μL的反向引物、ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件为：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物通过凝胶电泳分离后，目标条带用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，取1 μL pEASY-Blunt Zero载体与4 μL回收产物在PCR仪中25 ℃反应15 min后，将连接产物与50 μL的Trans1-T1感受态细胞混合，冰浴30 min后，42 ℃水浴45 s，冰浴2 min后加入500 μL的LB培养基，37 ℃，180转培养1 h，涂布于LB+氨苄培养基上37 ℃培养过夜。单克隆菌经菌液PCR鉴定后，阳性克隆送公司测序（北京睿博兴科生物技术有限公司生产），由测序结果获得TwMO cDNA全长序列。

2.3 雷公藤TwMO基因生物信息学分析 将测序得到的TwMO序列结果在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上Blast搜索蛋白质和核苷酸数据库，并在ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）上查找开放阅读框（ORF）和翻译成氨基酸序列。主要采用一些网上软件包进行生物信息学分析[15]，如采用Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/）进行结构域比对，ExPASy在线服务器的Compute PI/Mw（http：//web.expasy.org/compute_pi/）预测理论等电点与相对分子量，TRMHMMserver v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）进行跨膜域分析，SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）进行三维同源建模。用DNAMAN软件、ClustalW软件和MEGA 6软件分别对TwMO基因所编码的氨基酸序列进行多重比对，与其他来源的MO氨基酸序列进行比较和构建Neighbor-joining系统进化树。

2.4 雷公藤TwMO基因的表达分析 雷公藤悬浮细胞经茉莉酸甲酯诱导后，取不同诱导时间点（0，4，12，24，48，72 h）的雷公藤悬浮细胞，采用RNA提取试剂盒提取不同处理时间点的悬浮细胞的总RNA。用FastQuant RT Kit试剂盒反转录成cDNA，以雷公藤actin基因作为内参，进行TwMO基因相对表达检测，引物设计。见表1。反应体系：2×Fast qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，正反引物（10 mmol/L）各0.4 μL，PCR-grade water 7.8 μL，50×Rox High 0.4 μL。反应程序为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环：65～95 ℃做溶解曲线分析。反应结束后对荧光值扩增曲线和融解曲线进行分析。生物重复和技术重复各3次，采用2-△△CT法分析结果。

2.5 结果

2.5.1 雷公藤TwMO全长cDNA的获得 由雷公藤转录组数据通过全长PCR克隆得到TwMO基因的cDNA全长序列为一条2 193 bp的cDNA特异性片段，结果。见图1。

2.5.2 雷公藤MO基因序列分析 通过ORF Find在线软件对TwMO基因全长cDNA序列进行分析，预测其共编码507个氨基酸，且含有完整开放阅读框（Open reading frame，ORF），位于243～1 766 bp区域；序列的1～243 bp为5URT，1 766～2 193 bp为3 URT。Blast的结果显示TwMO与毛果杨Populus trichocarpa 81%相似，與甜橙Citrus sinensis 79%相似，与胡桃Juglans regia 77%相似，与麻风树Jatropha curcas 75%相似，与没药叶天竺葵Pelargonium myrrhifolium 75%相似等。Interpro结构域分析结果显示TwMO有与FAD结合有关的FAD/NAD（P）-binding domain（53～326，374～451）功能域。见图2。DANMAN对没药叶天竺葵（AKF43264）、长果种麻黄Corchorus olitorius（OMO88316）、土瓶草Cephalotus follicularis（GAV67558）、桃蝶木天竺葵Pelargonium tetragonum（AKF43266）、天竺葵Pelargonium x hortorum（AKF43268）、马德拉老鹳草Geranium maderense（AKF43250）、暗花老鹳草Geranium phaeum（AKF43251）和野大豆Glycine soja（KHN10936）的氨基酸序列进行多重序列比对，结果表明TwMO与其他植物的MO氨基酸序列具有较大的相似性，平均为82.46%。见图3。

2.5.3 TwMO氨基酸序列的系统进化分析 将雷公藤MO氨基酸序列与GenBank中其他30种生物的MO氨基酸序列进行比对分析，在软件MEGA6中采用相邻连接法构建系统进化树，进行聚类分析。见图4。TwMO在本文所选蛋白中与土瓶草的MO基因亲缘关系较近。

2.5.4 TwMO理化性质和3D结构预测 EsPASy在线软件对TwMO氨基酸序列的理化性质分析，结果为TwMO的蛋白质分子质量为55.2 kDa，等电点为8.84。跨膜域分析结果显示其为膜蛋白。见图5。TwMO三维同源模型以4n9x.1.A蛋白为模板构建TwMO蛋白的三级结构，该蛋白三级结构预测模型。见图6。

2.5.5 TwMO诱导表达分析 MeJA是一种广泛存在于植物中的防御激素，已有研究报道外源添加MeJA可以激发植物防御基因的表达，可以诱导植物次生代谢产物合成相关酶基因的表达，进而提高次生代谢产物在植物体中的产量[16-17]，使植物应对外界坏境的胁迫。根据实时荧光定量PCR检测诱导后TwMO基因表达实验的数据，采用2-△△CT相对定量表达分析。见图7。实验发现，经MeJA诱导后，雷公藤TwMO基因表达量迅速上调，在48 h达到最大，提示该基因与雷公藤中的活性成分的生物合成相关。

3 讨论

由于单加氧酶基因不仅对植物的生长发育起着重要的作用，同时也参与了中药活性成分的生物合成过程。研究单加氧酶的生化功能有助于通过分子水平揭示药用植物中活性成分的生物合成机制。本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到一条MO基因。为了能进一步研究其具体的生化功能，本研究通过生物信息学分析方法对其核苷酸和氨基酸序列了进行分析，结果显示TwMO与已报道的MO基因具有很高的相似性，并且TwMO具有MOs所共有的与FAD结合有关的FAD/NAD（P）-binding domain功能域。此外，外源的MeJA激素诱导雷公藤悬浮细胞后，实时荧光定量对TwMO基因的表达分析结果表明，TwMO在诱导后呈上升的趋势，表明其受到外源MeJA的调控，可能与植物的次生代谢产物合成有关。本研究克隆了TwMO的cDNA全长序列并对其理化性质和具体的生化功能进行的初步预测，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

参考文献

[1]高伟，刘梦婷，程琪庆，等.雷公藤的本草考证[J].世界中医药，2012，7（6）：560-562.

[2]刘为萍，刘素香，唐慧珠，等.雷公藤研究新进展[J].中草药，2010，41（7）：1215-1218.

[3]Yang H，Chen D，Cui Q C，et al.Celastrol，a triterpene extracted from the Chinese “Thunder of God Vine” is a potent proteasome inhibitor and suppresses human prostate cancer growth in nude mice[J].Cancer Research，2006，66（9）：4758-4765.

[4]Astry B，Venkatesha S H，Laurence A，et al.Celastrol，a Chinese herbal compound，controls autoimmune inflammation by altering the balance of pathogenic and regulatory T cells in the target organ[J].Clinical Immunology，2015，157（2）：228-238.

[5]Lu L，Li F，Wang X.Novel anti-inflammatory and neuroprotective agents for Parkinson′s disease[J].Cns & Neurological Disorders Drug Targets，2010，9（9）：232-240.

[6]Junli L，Jaemin L，Mario Andres S H，et al.Treatment of obesity with celastrol[J].Cell，2015，161（5）：999-1011.

[7]Corson T W，Crews C M.Molecular understanding and modern application of traditional medicines：triumphs and trials[J].Cell，2007，130（5）：769-74.

[8]Harayama S，Kok M，Neidle E L.Functional and evolutionary relationships among diverse oxygenases[J].Annual Review of Microbiology，1992，46（46）：565-601.

[9]Guo J，Ma X，Cai Y，et al.Cytochrome P450 promiscuity leads to a bifurcating biosynthetic pathway for tanshinones[J].New Phytologist，2016，210（2）：525-534.

[10]Zhao Q，Cui M Y，Levsh O，et al.Two CYP82D Enzymes Function as Flavone Hydroxylases in the Biosynthesis of Root-Specific 4′-Deoxyflavones in Scutellaria baicalensis[J].Molecular Plant，2017，11（1）：135-148.

[11]Porter TD.Electron Transfer Pathways in Cholesterol Synthesis[J].Lipids，2015，50（10）：927-936.

[12]Rasbery JM，Shan H，Leclair RJ，et al.Arabidopsis thaliana squalene epoxidase 1 is essential for root and seed development[J].Journal of Biological Chemistry，2007，282（23）：17002-17013.

[13]Laranjeira S，Amorim-Silva V，Esteban A，et al.Arabidopsis Squalene Epoxidase 3（SQE3）Complements SQE1 and Is Important for Embryo Development and Bulk Squalene Epoxidase Activity[J].分子植物：英文版，2015，8（7）：1090-1102.

[14]周家偉，刘雨佳，胡添源，等.雷公藤PTEN基因全长克隆及表达分析[J].中草药，2017，48（7）：1391-1396.

[15]胡添源，苏平，张逸风，等.雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析[J].中国中药杂志，2017，42（7）：1312-1318.

[16]Geyter ND，Gholami A，Goormachtig S，et al.Transcriptional machineries in jasmonate-elicited plant secondary metabolism[J].Trends in Plant Science，2012，17（6）：349-359.

[17]Misra RC，Ghosh S.Methyl jasmonate-elicited transcriptional responses and pentacyclic triterpene biosynthesis in sweet basil[J].Plant Physiology，2014，164（2）：1028-1044.