李莉梅　张婷婷　欧阳乐军　陈自银　陈凯钊　刘雅丽　尹爱国　布良灏

摘要：[目的]利用高效基因编辑系统（pHDE-Cas9）构建巨桉细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（CTX）基因家族规律成簇的间隔短回文重复（cRISPR）载体，为开展巨桉CTX基因家族功能验证研究打下基础。[方法]设计巨桉CTX基因靶位点和引物，扩增pCBC质粒上的目的片段，Bsa I酶切priDE载体并与目的片段连接形成重组质粒，转化DH5α感受态细胞。提取单克隆进行菌液PCR初步验证、重组质粒PCR验证，挑选阳性克隆质粒进行测序分析，构建CTX基因家族CRISPR载体。[结果]重组质粒PCR鉴定及测序结果表明，重组载体序列无突变，与预期序列高度一致。成功构建了巨桉CTX基因家族pHDE-CTXA、pHDE-CTXBtNpHDE-CTXC同源表达载体。[结论]利用pHDE-Cas9成功构建了巨桉CTx基因家族CRISPR载体，构建过程快速、高效，为桉树基因组定点编辑打下了基础，也可为其他桉树CRISPR/Cas9表达载体的构建提供借鉴。

关键词：巨桉；规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）；细胞分裂素氧化酶脱氢酶（cTX）；载体构建

中图分类号：S792.39 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0411-07

0引言

[研究意义]基因定点编辑技术是对基因组DNA特定位点进行改造的一种方法，在基因功能研究和种质遗传改良过程中发挥着重要作用。规律成簇的间隔短回文重复/间隔短回文重复关联蛋白系统（CRISPR/Cas系统）作为一种新型的基因编辑技术，近几拜来发展迅猛（Doudna and Charpentier，2014；Fan et a1.，2015；Donohoue et a1.，2017）。巨桉（Eu-calyptus uropyllla）属桃金娘科桉属植物，是目前唯一已完成基因组测序的桉树树种，可作为遗传背景清楚的桉树相关功能基因研究材料。细胞分裂素氧化酶脱氢酶（Cytokinase oxidase/dehydrogenase，CTX）是一种能将细胞分裂素（cTK）不可逆地降解為腺嘌呤/腺苷以维持植物体内CTK平衡的黄素酶，但目前未见利用CRISPR技术开展桉树离体再生过程中CTX基因因功能研究的报道。因此，构建巨桉CTX基因家族CRISPR载体，对促进CRISPR技术在桉树上的应用具有重要意义。[前人研究进展]CRISPR技术操作简单，效率高，能轻松实现对目标基因的敲除、替换和定点突变，目前已在多种动物和植物上成功应用（Feng et a1.，2014；刘慧慧等，2017；Zong et a1.，2017）。Santosh等（2015）、Xu等（2015）研究认为，CRISPR/Cas9系统是目前效率最高、最先进的基因组编辑技术，构建载体时操作更简便、成本更低廉；CRISPR能同时对多个基因、多个位点进行编辑。刘婷婷等（2015）研究认为，通过CTX的催化，CTK被降解失活，说明植物体内的CTK是在CTX调控下合成或分解，植物的生长发育受CTX的间接影响。王亚萍等（2017）报道认为，尝试利用CRISPR/Cas技术对特定基因或多基因同时进行敲除是功能基因组学研究简洁有效的方法。[本研究切入点]至今，利用高效基因编辑系统OHDE-Cas9构建巨桉CTX基因家族CRISPR载体的研究鲜见报道。[拟解决的关键问题]以CTX基因为编辑对象，通过同源重组方法构建巨桉CTX基因家族的定向编辑CRISPR载体，以期为验证CTX基因家族功能打下基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种与质粒 大肠杆菌DH5α受态细胞购自广州鼎国生物技术有限公司，模板质粒和载体质粒pHDE-Cas9由加州大学圣地亚哥分校赠送。

1.1.2主要试剂 卡那霉素、PEG 8000和6xDNALoading Buffer购自生工生物工程（上海）股份有限公司，Epicentre T5 Exonuclease、NEB Phusion DNA聚合酶、NEB Taq DNA Ligase和Bsa I限制性内切酶购自New England Biolabs公司（美国），100 mmol/LDTT（二硫苏糖醇）购自上海碧云天生物技术有限公司，DL5000 DNA Marker购白天根生化科技（北京）有限公司。

1.2试验方法

1.2.1巨桉CTX基因靶位点及引物设计 根据GenBank已公布的巨桉CTX基因家族序列设计高评分靶点，利用Rgenome评估其脱靶情况；候选识别位点的毗邻基序（PAM序列）为NGG，分别设计3对打靶序列引物。将引物CTXA-F和CTXA-R扩增的目的片段命名为CTXA，引物CTXB-F和CTXB-R扩增的目的片段命名为CTXB，引物CTXC-F和CTXC-R扩增的目的片段命名为CTXC。

将目的基因序列输入在线评估低脱靶、高评分的靶点设计网站http：//www.crisprscan.org/page=se-quencer，根据网站自动生成的评分设计靶点引物。PCR引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.2.2 PCR扩增 以含gRNA序列的质粒为模板，用表1中的3对特异引物分别扩增CTX基因家族的3个基因打靶序列片段，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，切下目的条带，放入1.5 mL离心管后置于-20℃冰箱冷冻15 min，15000 r/mim离心10 min，回收纯化后的片段用超微量分光光度计测定浓度后，将其余回收片段暂存于4℃冰箱，用于后续与载体连接。PCR反应体系20.0μL：10×Buffer2.0μL，10 mmol/L dNTPs 1.0μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，10 pmol/L Primer-F 1.0μL，10 pmol/L Primer-R1.0μL，DNA模板0.5μL，100 ng/μL pCBC 1.0μL，ddH：O补足至20.0 pL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，进行30个循环；最后72℃延伸2 min。

1.2.3 priDE载体酶切 priDE载体用Bsa I酶切成线性化载体，酶切反应条件：50℃，过夜酶切。酶切反应体系20.0μL：酶切缓冲液（Cut smart）2.0μL，Bsa I（10 U）0.8μL，priDE质粒（850 ng/μL）3.0μL，ddH20补足至20.0μL。酶切产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.4重组质粒构建 酶切好的priDE载体和PCR扩增目的片段按照1：5混合，再加入重组酶，50℃连接反应1 h后用热激法转化DH5a感受态细胞。连接组装体系9.0μL：priDE载4，0.8止μL，目的片段（20 ng/μL）4.0μL，NEB Taq DNA Ligase 4.2μL。

1.2.5重组质粒鉴定 每个同源载体从转化后的培养基上挑取单克隆，接种至500.0 μL LB培养基中，37℃下200 r/mim摇床培养5 h后进行PCR鉴定。PCR反应体系20.0μL：10xBuffer 2.0μL，10 mmol/LdNTPs 1.0μL，EX Taq DNA聚合酶0.5μL，10 pmol/LPrimer-F 1.0μL，10 lamol/L Primer-R 1.0μL，菌液模板1.0μL，ddH20补足至20.0μL。扩增程序：94℃预变性30 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，进行30个循环；最后72℃延伸2 min。

重组菌液经PCR鉴定后，挑选阳性克隆置于30.0 mL LB培养基中，加入30.0μL卡那霉素，37℃下200 r/mim摇床过夜培养，第2 d提取质粒，用超微量分光光度计测定浓度后进行PCR扩增检测，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR反应体系20.0μL：10xBuffer 2.0μL，10 mmol/L dNTPs 1.0μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5μL，10 pmol/L Primer-F 1.0μL，10 pmol/L Primer-R 1.0μL，质粒模板（100 ng/μL）1.0μL，ddH20补足至20.0μL。扩增程序：94℃预变性30 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，进行30个循环；最后72℃延伸2 min。

1.2.6重组质粒测序验证 挑选重组质粒PCR鉴定呈阳性的克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2结果与分析

2.1CTX基因的PCR扩增结果

从图1可看出，目的片段CTXA、CTXB和CTXC经PCR扩增后的基因片段长度为500-750 bp，与预期结果相符，即PCR扩增片段长度正确。切胶回收目的片段，-20℃冷冻后，12000 r/mim离心10 min回收作为与载体组装的目的片段。

2.2 pHDE载体酶切后的电泳结果

从图2可看出，Bsa I酶已完全将priDE载體切开，与未经酶切的质粒比对发现，Bsa I酶切的质粒线性化载体浓度较高，线性化完全，可用于后续的重组连接。

2.3重组载体菌落的PCR鉴定结果

在转化后的抗性培养基上各随机挑取数个单克隆进行培养，以含重组质粒的菌液为模板进行PCR鉴定，结果（图3）显示，PCR扩增的目的条带与阳性对照条带大小一致，约600 bp，阳性率达100%，初步确定priDE-CTXA、priDE-CTXB和priDE-CTXC构建成功。

2.4重组质粒的PCR鉴定结果

从图4可看出，以从2.3阳性结果中随机挑选6个重组质粒为模板进行重组质粒PCR扩增，6个样品均能扩增出约600 bp片段，与阳性对照一致，证明重组载体构建成功。

2.5重组质粒的测序结果

从PCR鉴定呈阳性的6个重组质粒中随机挑选1个质粒进行测序，并对测序结果进行DNASTAR分析（图5～图7）。从图5可看出，priDE-CKXA质粒预期序列为CTKA standard Seq，靶点基因敲除后的预期序列为No-treatment Control Group Seq，序列分析CTXAstandard Seq与测序结果一致，priDE-CTXA重组质粒未发生突变，测序峰图对比的序列未出现异常，说明pHDE-CTXA重组载体构建成功。从图6可看出，pHDE-CTXB重组质粒预期序列为CTXB standardSeq，靶点基因敲除后的预期序列为No-treatmentControl Group Seq，序列分析CTXB standard Seq与测序结果一致，priDE-CTXB未发生突变，测序峰图对比的序列未出现异常，说明pHDE-CTXB重组载体构建成功。从图7可看出，priDE-CTXC重组质粒预期序列为CTXC standard Seq，靶点基因敲除后的预期序列为No-treatment Control Group Seq，序列分析CTXC standard Seq与测序结果一致，priDE-CTXC未发生突变，测序峰图对比的序列未出现异常，说明priDE-CTXC重组载体构建成功。

3讨论

用传统的克隆方法构建一个载体需对目的基因进行PCR扩增、胶回收、目的片段和载体酶切回收、连接转化及鉴定等操作，整个过程需耗时4～5 d（付莉莉等，2016）。本研究与其不同，采用同源重组技术进行重组质粒构建时无需回收插入片段和载体，组装时间短，整个过程仅需2-3 d，且重组质粒比率达100%，重组效率高。相对于传统的基因克隆技术，同源重组技术无须对PCR产物进行纯化、酶切等特殊处理，也不受酶切位点的限制，能在载体无法选择合适酶切位点时实现基因克隆；在引物设计时无需引入酶切位点的保护性碱基，避免对酶切效率产生影响，从而降低克隆失败的概率（Brooks，et a1.，2014）。

CRISPR是一种简单高效、能在全基因组水平上选择对目的基因调控表达的技术，与传统的RNA干扰技术（RNAi）相比，效率更高，用于开展基因功能研究更直接，获得的结论更可靠（Doudna and Char-pentier，2014），通过CRISPR干扰可沉默任意数量的单个基因（Mao et a1.，2017），對靶目标位点的选择也十分灵活，可实现对所有基因进行定点编辑（Mus-solino and Cathomen，2013；Brooks et al.，2014）。本研究结果也表明，根据Crisprscan找到目的基因的高评分靶点，利用Rgenome评估其脱靶情况，根据低脱靶高评分的靶点设计引物，用特异性引物扩增CTXA、CTXB和CTXC 3个目的片段，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，产物用低温冷冻法高速离心即得到纯化的CTXA、CTXB和CTXC片段，纯化后的片段在重组酶作用下与经Bsa I酶切后线性化的priDE载体相连接，重组子通过菌落PCR初步验证、重组子单克隆PCR验证及最后的测序验证，已成功构建priDE-CTXA、oHDE-CTXB和pHDE-CTXC 3个同源表达载体，可为桉树其他CRISPR/Cas9表达载体的构建提供借鉴，也可进一步利用根瘤农杆菌介导将CRISPR/Cas9转入巨尾桉的愈伤组织，获得转基因型愈伤组织或转基因尾巨桉，并通过检测突变材料中细胞分裂素合成酶的合成情况，验证CRISPR/Cas9表达载体的有效性，推动桉树分子育种技术及基因功能研究进程。

桉树是我国南方重要的工业用材林树种，具有速生、丰产特性及良好的经济、生态和社会效益（邓紫宇等，2016；Ouyang and Li，2016）。近年来，桉树再生及转化体系的高效建立及基因工程技术的成功应用，为定向改良其基因组成、研究相关基因功能奠定了基础。本研究使用高效基因组定向编辑的CRISPR/Cas9技术体系，无需引入外源基因，不存在转基因争议，生物安全性高（Hui et a1.，2014；Zhanget a1.，2016），为桉树材质改良、抗性育种提供了一种具有广阔应用前景的技术体系。

4结论

本研究利用pHDE-Cas9成功构建了巨桉CTX基因家族CRISPR载体，构建过程快速、高效，为桉树基因组定点编辑打下了基础，也可为其他桉树CRIS-PR/Cas9表达载体的构建提供借鉴。

（责任编辑 思利华）