陈芳芳 曹曦跃 刘颖 刘梦佳 颜佳超 杨富强 曹毅 乔代蓉

摘 要：从短小芽孢杆菌中克隆阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43并重组表达，有利于将该酶分离纯化后应用于其他半纤维素多糖的水解。该研究利用E. coli BL21表达系统对实验室克隆到的短小芽孢杆菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43进行重组表达并分析其酶学性质，将重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43和来源于棒曲霉突变菌株的商业木聚糖酶联合作用于燕麦木聚糖。结果表明：以燕麦木聚糖为底物，重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43的最适温度为50 ℃，最适pH为6.0。该酶在pH 5.0～10.0和45～55 ℃下较稳定。与木聚糖酶单独作用相比，重组Xyn43酶与商业木聚糖酶同时加入以及先用木聚糖酶水解后加入Xyn43酶，水解产物中的还原糖含量分别增加了16%和20%，木糖含量增加了35%和48%。该结果研究结果表明重组Xyn43酶能够和商业木聚糖酶协同降解燕麦木聚糖，提高水解效率，产生更多的木寡糖，阿拉伯糖和木糖。

关键词：α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶， 木聚糖酶， 燕麦木聚糖， 重组表达， 协同作用

中图分类号：Q946

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）04-0444-07

Abstract：Hemicellulose is a rich renewable resource， which is one of the most promising raw materials for the production of biofuels. α-L-arabinofuranosidase （EC 3.2.1.55） is an auxiliary enzyme in hemicellulose hydrolase system which catalyzes the α-L-1，2， α-L-1，3 and α-L-1.5-arabinofuranoside residues in non-reducing terminal of various oligosaccharides and polysaccharides. Bacillus pumilus is a widely used， bio-friendly feed microbial strain that can degrades mannan， xylan， cellulose and so on. Therefore， cloning the α-L-arabinofuranosidase gene xyn43 from B. pumilus and recombinant expression is beneficial to the separation and purification of the enzyme and it can be applied to the hydrolysis of other hemicellulose polysaccharide. In this study， we used the E. coli BL21 expression system to express the α-L-arabinofuranosidase gene xyn43 isolated from the B. pumilus and then analyzed the enzymatic properties of recombinant enzyme Xyn43. And we used Xyn43 and commercial Xylanase derived from the mutant strain of Aspergillve clavatus to degrade the oat spelt xylan. The results showed that the optimal temperature of Xyn43 was 50 ℃ and the optimum pH was 6.0. It was stable over a pH range of 5.0 -10.0 and temperatures of 45-55 ℃. Compared with Xylanase alone， the reducing sugar content in the hydrolyzate of Xyn43 and Xylanase added simultaneously and Xyn43 added after Xylanase increased 16% and 20% respectively， and the xylose content increased of 35% and 48%. The studies indicate that Xyn43 is able to synergistically with commercial Xylanase for oat spelt xylan degradation and can improve the hydrolysis efficiency， produced more xylosaccharides， arabinose and xylose.

Key words：α-L-arabinofuranosidase， xylanase， oat spelt xylan， recombinant expression， synergistic effect

半纤维素是植物细胞壁结构中含量仅低于纤维素的第二大碳水化合物高聚物，不同于均多糖纤维素，它是由戊糖（D-木糖， L-阿拉伯糖），己糖（D-葡萄糖， D-半乳糖， D-甘露糖）和一些酸性多糖（半乳糖醛酸和葡糖醛酸）等不同类型单糖组成的杂多糖（余紫苹等，2011）。通过生物技术方法能够将这些低成本的生物质转变成有价值的产品，如乙醇和工业化学品等，因此半纤维素有着巨大的潜在利用价值，被认为是生产生物燃料的最有前景的原料之一（朱晨杰等， 2015）。由于半纤维素的结构复杂，其完全水解需要多种酶的共同参与，主链水解酶内切β-1，4-木聚糖酶（EC 3.2.1.8）水解β-1，4-木糖苷键释放木二糖，β-木糖苷酶（EC 3.2.1.37）从木二糖和短链低聚木糖中释放出木糖。半纤维素中大量取代基的存在阻碍了主链水解酶的降解，一些木聚糖酶不切割被取代的木糖单元之间的糖苷键，因此在主链完全水解之前侧链必须裂解。木聚糖上的L-阿拉伯呋喃糖基侧链严重抑制了木聚糖水解酶的活性，因此阻碍了多聚物完全水解为其基本木糖单元（Shallom et al， 2002）。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是外切型酶，其水解來自含有阿拉伯糖的多糖的末端非还原残基，特异地催化各类低聚糖和多糖的非还原末端的α-L-1，2-，α-L-1，3-和α-L-1，5-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解，同其他半纤维素水解酶协同作用能够促进这些酶的水解活力。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是木聚糖水解酶系统中不可缺少的一部分，代表了木聚糖水解进程中潜在的限速酶（Saha & Bothast， 1999）。基于氨基酸序列，基本结构相似性和疏水性将α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶分类为5个水解酶家族（GHs），即GH3、GH43、GH51、GH54和GH62 （Henrissat & Davies， 2000）。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶可同其他半纤维素酶协同作用，使半纤维素得到充分水解（de Vries et al， 2000）。将青霉菌ATCC 62998编码的内切木聚糖酶基因XynC和黑曲霉ATCC 1015编码的阿拉伯呋喃糖苷酶基因AbfB在构巢曲霉A773中重组表达后协同水解甘蔗渣浆，与XynC单独作用相比，加入AbfB后水解产物中还原糖含量提高了54%～85%（Goncalves et al， 2012）。从嗜热特异腐质霉Y1 （Yang et al， 2015）分离到的一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶协同作用，两种酶同时加入和先加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶后加木聚糖酶，从桦木木聚糖中产生的还原糖含量分别为木聚糖酶单独作用的1.01和1.20倍。来源于链霉菌属PC22 （Raweesri et al， 2008）的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和两种主链水解酶（木聚糖酶和β-木糖苷酶）协同水解燕麦木聚糖，与两种主链水解酶单独作用相比，加入α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶后还原糖含量增加了17%。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在增加这些半纤维素的还原糖释放量中起重要作用，其协同作用增加了小分子量木寡糖的产量。将α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶联合降解木聚糖，能使木聚糖更加充分水解，产生更多木寡糖和单糖。

本研究将从短小芽孢杆菌克隆到的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43在E. coli BL21（DE3）原核表达系统中重组表达，得到分子量为71 kDa的重组蛋白，分析了重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43的酶学性质。将重组Xyn43酶和商业木聚糖酶联合水解燕麦木聚糖，将两种酶单独，按先后顺序及同时加入。不仅比较了水解产物中还原糖的含量，同时分析了阿拉伯糖和木糖的含量变化。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株与质粒：大肠杆菌E.coli BL21（DE3）和质粒pET-32a（+）为本实验室保存。主要试剂：D-木糖，L-阿拉伯糖，和燕麦木聚糖购自BIOMED公司；棒曲酶（Aspergillve clavatus）的突变菌株商业木聚糖酶，购自上海康达食品；其他生化试剂为国产分析纯，购自成都科龙化工试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 xyn43的克隆和重组表达 本实验室已克隆到xyn43基因，但未能在大肠杆菌E.coli BL21 （DE3）中成功表达。氨基酸序列分析结果表明该蛋白可跨细胞膜运输至胞外，属于胞外蛋白。故在未去除信号肽的情况下，重组蛋白被分泌至胞外，故未见目的条带表达。因此本研究根据实验室已构建的工程菌质粒为模板分别设计带有BamH I和Xho I的设计去除信号肽的PCR扩增引物：xyn43-PF（CGGATCCGCAAGCACAACAATTGC）和xyn43-PR（CCGCTCGAGTTACCTTTGAGTAAACTGCC）。以克隆到的未去信号肽的xyn43质粒DNA为模板，利用引物xyn43-PF和xyn43-PR扩增xyn43的基因序列。PCR扩增产物胶回收后，使用限制性内切酶BamH I和Xho I分别对xyn43基因和pET32a质粒DNA进行双酶切。将双酶切过后的xyn43目的基因片段和pET32a载体片段用T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒xyn43-pET-32a。然后将重组表达质粒xyn43-pET-32a转入大肠杆菌E. coli BL21 （DE3）中进行xyn43的重组表达。

1.2.2 重组蛋白Xyn43的纯化 将重组菌体接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中活化菌株，然后转接到新的含氨苄的LB液体培养基中，待菌体生长至OD600为0.6～0.8之间时，加入终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG于16 ℃下诱导16 h表达重组蛋白，离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬后超声破碎，4 ℃，12 000 r·min-1，离心20 min。将上清即粗酶液进行蛋白纯化，通过镍柱进行亲和层析。采用连续洗脱的方式将不同咪唑浓度的缓冲液混合洗柱，收集洗脱蛋白，SDS-PAGE检测洗脱蛋白的纯度。

1.2.3 Xyn43酶活力的测定 以燕麦木聚糖为底物，反应体系为1 mL，其中含500 μL 1%（w/v）燕麦木聚糖和用pH 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液适当稀释的酶液，50 ℃反应10 min后，加入1 mL DNS终止反应，测定540 nm下的吸光值。以每分钟水解木聚糖产生的相当于1 μmol D-木糖的还原糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位（IU）。

1.2.4 Xyn43酶学性质研究 pH对酶活力的影响：分别配制含1%燕麦木聚糖的pH 3.0～10.0的缓冲液：100 mmol·L-1柠檬酸-Na2HPO4 缓冲液（pH 3.0～7.0），50 mmol·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（pH 8.0），50 mmol·L-1甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0～10.0）。在50 ℃条件下水浴反应10 min测定酶活力，其中酶活力最高的设为100%。

温度对酶活力的影响：用最适pH缓冲液将酶液适当稀释，分别在30、40、50、60、70、80 ℃的温度下测定酶活力，反应10 min，其中酶活力最高的设为100%。

pH稳定性分析：取适量酶液分别放置于pH 3.0～10.0的缓冲液中，37 ℃水浴放置1 h，于最佳反应条件下水浴10 min测定剩余酶活力，其中最高酶活力设为100%。

热稳定性分析：将适量的酶液分别放置在45、50和55 ℃恒温水浴下1 h，每间隔10 min取样一次，然后于最适温度和最适pH条件下反应10 min测定剩余酶活力，将保温0 min时的初始酶活力设为100%。

1.2.5 Xyn43與商业木聚糖酶的协同作用 以1%（w/v）燕麦木聚糖为底物，首先分别用重组Xyn43酶（3.6 μg·μL-1）单独水解6 h；木聚糖酶（0.7 μg·μL-1）单独水解6 h； 重组Xyn43酶和木聚糖酶共同水解6 h。然后， 先加木聚糖酶水解6 h后煮沸冷却后，再加重组Xyn43酶继续反应6 h；先加重组Xyn43酶水解6 h后煮沸冷却后，再加木聚糖酶继续反应6 h，反应温度为37 ℃。最后，将反应液煮沸离心收集上清，用DNS法测定还原糖含量，并用高效液相色谱法分析水解产物中阿拉伯糖和木糖的含量。

2 结果与分析

2.1 xyn43的克隆和表达纯化

根据设计的引物进行基因序列扩增得到PCR扩增产物（图1：A），该基因全长1 458 bp，编码485个氨基酸，预测的蛋白分子量为71 kDa。将构建好的重组质粒xyn43-pET-32a转入大肠杆菌E. coli BL21（DE3）中诱导表达，通过镍柱进行亲和层析分离纯化蛋白，SDS-PAGE电泳结果表明，重组Xyn43蛋白分子量与预测的蛋白大小基本一致（图1：B）。

2.2 Xyn43的酶学性质

2.2.1 Xyn43的最适pH和温度 在pH3.0～10.0的缓冲液中测定Xyn43的酶活力，图2结果表明，Xyn43的最适pH为6.0，在pH6.0～8.0之间能保持在80%以上的相对酶活力，当缓冲液pH小于5.0或大于9.0时该酶的相对酶活低于50%。在30～80 ℃温度范围内测定Xyn43的酶活力，图3结果表明，该酶的最适反应温度为50 ℃，温度在30～40 ℃时相对酶活保持在75%以上，当反应温度为60 ℃时该酶的相对酶活约为55%，温度高于70 ℃时，相对酶活降低到30%以下。

2.2.2 Xyn43的pH稳定性和热稳定性 取适量酶液分别放置于pH3.0～10.0的缓冲液中，37 ℃水浴放置1 h，于最适反应条件下测定剩余酶活力，其中酶活力最高的设为100%。图4结果表明，重组Xyn43酶在pH8.0的缓冲液中稳定性最好，在pH5.0～10.0之间较稳定且相对酶活保持在70%以上，在pH3.0～4.0酸性条件下放置1 h后相对酶活力残留30%以下。

将适量酶液分别在45、50、55 ℃温度下恒温水浴1 h，每间隔10 min取酶液于最适反应条件下测定剩余酶活力，将保温0 min时的酶活力设为100%。图5结果表明，该酶在45、50、55 ℃条件下比较稳定，其中45 ℃时最稳定，1 h后酶活力仍能保留为75%左右，50 ℃和55 ℃为其次，1 h后分别能残留65%和68%左右的酶活力。

2.3 Xyn43与商业木聚糖酶协同水解燕麦木聚糖

将重组Xyn43酶与来源于棒曲霉突变菌株的商业木聚糖酶协同水解燕麦木聚糖，以1%（w/v）燕麦木聚糖为底物，将重组Xyn43酶和木聚糖酶同时、先后或单独加入反应体系中，通过DNS法测定水解产物中还原糖的含量，并用高效液相色谱法对水解产物中阿拉伯糖和木糖含量进行分析。由表1可知，当重组Xyn43酶和木聚糖酶同时加入，先加木聚糖酶后加重组Xyn43酶，先加重组Xyn43酶后加木聚糖酶产生的还原糖含量分别为木聚糖酶单独作用的1.16，1.20和0.92倍。由表2可知，相较于木聚糖酶单独作用，两种酶同时作用或先加木聚糖酶后加Xyn43酶，木糖含量分别增加了35%和48%，而先加重组Xyn43酶后加木聚糖酶产生的木糖含量为木聚糖酶单独作用的88%。与先加重组Xyn43酶后加木聚糖酶相比，两种酶同时加入和先加木聚糖酶后加重组Xyn43酶产生的阿拉伯糖含量分别提高了72%和94%。

3 讨论与结论

半纤维素作为一种丰富的可再生资源，其产物可作为饲料和生物能源，国内外对木质纤维素的开发利用越来越重视和广泛关注。通过生物技术法将这些低成本的生物质转变成有价值的产品，如乙醇和工业化学品，对于生态环保来说是必不可少的。半纤维素是一种结构复杂的多取代的高度分枝的异质多糖， 其生物降解需要一个酶系统参与完成，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是参与酶水解L-阿拉伯糖链的酶，能有效水解果胶、半纤维素残留的多糖（阿拉伯聚糖，脱支阿拉伯聚糖）、阿拉伯糖半乳聚糖和阿拉伯木聚糖等，在降解半纤维素的过程中，能促进其他半纤维素酶的水解，提高水解效率。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶作为主要的木聚糖侧链水解酶，在工业生产上被广泛应用（Saha， 2000； Numan & Bhosle， 2006），包括酿酒、面包工艺、果汁处理、生物乙醇、保健药品的生产等。

本研究将从短小芽孢杆菌中克隆到的编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43在E. coli BL21中成功表达，构建了工程菌xyn43-pET32a高产菌株。该酶是一种单一的阿拉伯呋喃糖苷酶，具有较好的温度稳定性和广泛的pH耐受性。将Xyn43酶与来源于棒曲霉突变菌株的商业木聚糖酶协同水解燕麦木聚糖，结果表明两种酶同时作用和先加木聚糖酶后加Xyn43酶，水解產物的还原糖含量，木糖和阿拉伯糖含量都有明显提高，水解效率高于木聚糖酶单独作用，但先加入Xyn43酶后加入木聚糖酶产生的还原糖，阿拉伯糖和木糖含量反而低于木聚糖酶单独作用。这一现象在之前的研究中也被报道过，如从嗜热特异腐质霉Y1（Yang et al， 2015）分离到的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和木聚糖酶协同作用，按先木聚糖酶后α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的顺序水解桦木木聚糖，产生的还原糖含量为木聚糖酶单独作用的98%。这可能是因为先加入Xyn43酶，产生了少量的阿拉伯糖，从而抑制了木聚糖酶的酶活力，也可能是因为Xyn43酶结合在了木聚糖酶的底物结合位点，导致木聚糖酶与底物的结合能力降低，这与底物的结构和酶的作用机制等相关，具体原因还需后续对酶的作用机制进一步研究来探讨。本研究的水解产物中含有木寡糖，阿拉伯糖和木糖，木聚糖酶单独作用时只能产生木寡糖和少量的木糖，不能生成阿拉伯糖，在木聚糖酶中加入Xyn43酶后，不仅生成了阿拉伯糖，木糖的产量也有提高。其中先加木聚糖酶后加Xyn43酶产生的木糖和阿拉伯糖含量最高，同时发现当先加木聚糖酶后加Xyn43酶或者两种酶同时作用时木寡糖峰与其他酶组合相比会有明显的下降，而阿拉伯糖峰则会相应的升高，产生的阿拉伯糖含量更多。这可能是因为当木聚糖酶先作用时，产生了大量的木寡糖，Xyn43酶能从这些木寡糖的侧链中水解产生阿拉伯糖。这表明Xyn43酶不仅能从燕麦木聚糖这样的多聚糖的侧链水解释放阿拉伯糖，也能水解木寡糖侧链的一些阿拉伯糖残基，产生阿拉伯糖。

目前，商业半纤维素酶制剂需要富集几种辅助酶，包括阿拉伯呋喃糖苷酶以有效地将半纤维素转化为单糖，但稀酸预处理后会抑制随后的微生物发酵副产物的生产。在碱性条件下处理不仅避免了酸处理带来的环境污染，也能够减少对微生物发酵的抑制。本研究中的重组阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43是一种强耐碱性酶，且能显著促进木聚糖的酶活力，提高水解效率，因此可作为商业半纤维素酶的辅助酶，用于生物质资源的生物转化。

此外，L-阿拉伯糖苷残基广泛分布于半纤维素的侧链中。L-阿拉伯糖是一种带有甜味的不易被人体吸收的摄取量低的单糖，可作为可能的食品添加剂（Matsuo et al， 2000）。同时L-阿拉伯糖能选择性地竞争性抑制肠蔗糖酶，在动物摄取蔗糖后能够降低血糖反应（Seri et al， 1996）。这些研究表明L-阿拉伯糖可作为一种生理功能的糖用于抑制蔗糖消化，用来防止糖尿病人餐后高血糖。本研究中的Xyn43能够从燕麦木聚糖和木寡糖的侧链水解释放阿拉伯糖，不参与水解燕麦木聚糖主链，没有木聚糖酶活力。因此Xyn43可以参与含有阿拉伯糖苷的多聚糖和木寡糖的水解，生成阿拉伯糖，同时提高木寡糖和木糖的产量。其中木寡糖可作为益生元，木糖能够用于乙醇发酵。由此可见Xyn43在阿拉伯糖的生产和半纤维素等多聚糖的生物降解过程中发挥着重要的作用，对半纤维素等生物质的有效利用及生物转化具有重要的参考价值，具有广阔的应用前景。

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