张秋玲 韩超 徐俊 杨柳 梁慧玲 杨洁颖

摘要目的：探讨翘芩清肺剂在改善哮喘气道炎症及其可能的作用机制。方法：选取雌性SD大鼠50只，制备哮喘大鼠模型并随机分成5组，即正常组、模型组、地塞米松组和翘芩清肺剂低、高剂量组。分别采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞介素1（IL1）、IL5及干扰素γ（IFNγ）的含量，并观察肺组织病理学改变；用免疫组织化学染色法观察细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）在肺组织内的表达，转化生长因子（TGF）β1在支气管组织内的表达；用实时定量聚合酶链反应（Realtime PCR）测定气道平滑肌组织中ERK mRNA含量。结果：模型组中ERK蛋白含量及mRNA水平，TGFβ1蛋白表达较正常组有显著增加（P<005）；与模型组比较，各干预组均能明显降低ERK mRNA及TGFβ1蛋白水平（P<005）。结论：翘芩清肺剂可明显改善哮喘大鼠的呼吸道症状，对气道具有保护作用，其作用机制可能与调节IL4/IFNγ平衡失调、抑制ERK通路的磷酸化，减轻气道炎症有关。

关键词翘芩清肺剂；气道炎症；ERK信号通路；转化生长因子β1

Study on Effects of Qiaoqin Qingfei Formula on ERK Pathway in Airway Smooth Muscle Cell of Asthmatic Rat

Zhang Qiuling1， Han Chao1， Xu Jun2， Yang Liu2， Liang Huiling1， Yang Jieying1

（1 Guangzhou Hospital of Chinese Medicine， Guangzhou 510130， China； 2 School of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632， China）

AbstractObjective：To investigate the Qiaoqin Qingfei Formula in improving airway inflammation and its possible mechanism. Methods：Fifty female SD rats with asthma were randomly divided into 5 groups：normal group， model group， dexamethasone group and， low and high dose group of Qiaoqin Qingfei Formula. The contents of interleukin1 （IL1）， interleukin5 （IL5） and interferon gamma （IFNγ） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were detected with ELISA method after administration. The proteins expression of the Erk1/2 of the lung tissues and the TGFβ1 of the bronchial tissues were analyzed by Western blot method and the mRNA expression of ERK1/2 of the bronchial tissues were analyzed by Realtime PCR. Results：Compared with normal group， the mRNA expression of ERK and the protein expression of TGFβ1 were significantly increased （P<001）. Compared with the model group， all the treatment groups significantly decreased the expression of the ERK mRNA and the protein of TGFβ1 （P<005001）. Conclusion：Qiaoqin Qingfei Formula can significantly improve the symptoms of respiratory tract which has a protective effect on asthmatic rats. Its mechanism may be related to the inhibition of the phosphorylation of ERK signaling pathway， regulation of IL4/IFNγimbalance and reduction of inflammatory cell infiltration.

Key WordsQiaoqin Qingfei Formula； Airway inflammation； ERK signal pathways； TGFβ

中圖分类号：R2895文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.037

支气管哮喘（哮喘）是由肥大细胞、嗜酸性粒细胞等多种炎性反应细胞参与的以慢性气道炎性反应和气道高反应性为特征的慢性呼吸道系统疾病。细胞外信号调节激酶（Extracellularsignal Regulated Kinase，ERK）是丝裂原活化激酶（MAPKs）家族中的重要成员之一，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生理病理过程，作为一个重要的第二信号转导通路，参与了哮喘气道慢性炎性反应、气道高反应性（AHR）和气道平滑肌的增殖等多种病理生理过程[12]。近年来国内外有关ERK通路在哮喘发病机制中作用已成为研究热点之一。翘芩清肺剂为我院呼吸内科总结多年临床经验所拟的验方，并制成院内制剂临床使用20余年，治疗急慢性支气管炎临床疗效显著，深受广大病患欢迎。研究发现，其在防治哮喘方面也有良好效果。本研究拟通过卵清蛋白（OVA）诱导大鼠制备哮喘的动物病理模型，观察翘芩清肺剂对大鼠气道炎症的影响及初步探讨其可能的作用机制，现报道如下。

1材料与方法

11材料

111动物选取SPF级SD大鼠50只，雌性，6～8周龄，体重150～180 g，由广东省医学实验动物中心提供（实验动物生产许可证号：SCXK（粤）20130002）。实验动物许可证号：SCXK（粤）20122017。实验室常规饲养条件20～25 ℃室温，自由饮食。

112药物翘芩清肺剂（下简称翘芩，由广州市中医医院制备，25 kg生药量/L）；地塞米松（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：140692）。

113试剂与仪器Sigma卵清鸡白蛋白（OVA）（USA，批号：A5253）；生理盐水（常州兰陵制药有限公司，批号：H52020069）；氢氧化铝干粉（广州化学试剂厂，批号：201912012）；8%和10%免疫印迹预制胶（弗德生物有限公司，批号：20150501）；TGFβ抗体（Cell Signaling，批号：3711S）；BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0012S）；RIPA蛋白裂解液（武汉博士德生物技术有限公司，批号：10C09A05）；IFNγ、IL4、IL5检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Western Blotting Luminol Reagent（PIERCE）；预染蛋白质Marker（Fermentas）；PrimeScriptR RT reagent Kit、SYBRR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）；PVDF膜（BioRad）；RNAiso Plus（Takara宝生物工程（大连）有限公司，批号：AA16071）；曝光胶片（富士）；蛋白酶抑制剂混合物（Cocktail，100×）；APS、TEMED（SigmaAldrich）；Tween20（Aresco）；其余试剂均为国产分析纯以上。

JJ12J型脱水机（武汉俊杰电子有限公司）；402AI型超声雾化器（鱼跃股份有限公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JBP5型包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；KDP型组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；JBL5型冻台（武汉俊杰电子有限公司）；ISRDD3型恒温振荡器（美国Crystal Technology公司）；M114型显微镜（OPTIKA）；ST16R型高速冷冻离心机（美国Thermo Sorvall公司）；凝胶电泳、电转仪（美国BioRAD公司）；PB602L型电子分析天平（瑞士METTLER公司）；UV7504型单光束紫外可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；Safire2型全波长多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）。

12方法

121分组与模型制备随机选取50只大鼠，经7 d适应性饲养后，采用文献[34]方法制备哮喘模型。适应性饲养1周后，按大鼠体重随机分成5组：对照组、模型组、地塞米松组、翘芩高剂量组和低剂量组，每组10只。模型及药物组大鼠在实验第1、8天分别腹腔注射10%卵清蛋白（OVA）混悬液1 mL致敏，正常组给予生理盐水腹腔注射1 mL。从第15天起，将大鼠置于密闭有机玻璃箱中用超声雾化器喷雾，任大鼠自行吸入，进行激发造模。每次喷雾1% OVA混悬液（正常组用生理盐水代替）。1次/d，30 min/次，连续2周。

122给药方法自大鼠首次致敏第2天开始，各组动物均以相应药物灌胃。第15天开始在给药30 min后进行激发，（地塞米松组自第15天后，隔天给药）；1次/d，共4周：正常组：生理盐水5 mL/（kg·d）；模型组：生理盐水5 mL/（kg·d）；地塞米松组：027 mg/（kg·d）；翘芩高剂量组：26 g/（kg·d）；翘芩低剂量：65 g/（kg·d）。

123标本采集及相关检测连续给药2周后，于末次激发后24 h内进行腹腔麻醉（4%戊巴妥钠，1 mL/kg体重）取材：1）肺泡灌洗液（BALF）：打开大鼠胸腔后，选取右肺进行支气管肺泡灌洗术，把09%氯化钠注射液5 mL，以25 mL/次注入气管内，缓慢反复抽吸，将灌洗液留取3～4 mL，于4 ℃、2 000 r/min离心15 min，取上清液用于白细胞介素4（IL4）、白细胞介素5（IL5）及干扰素γ（IFNγ）的含量测定，具体步骤按酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒说明操作。2）肺组织：迅速打开大鼠胸腔，分离肺组织，以10%甲醛固定24 h，常规脱水，石蜡包埋切片。3）气道组织：打开颈部皮肤，分离气管，切取气管至支气管段，冰冻切片，以10%甲醛内固定24 h，常规石蜡切片。

1231肺组织病理观察左上叶肺组织切片，苏木精伊红（HE）染色后于镜下观察肺部病理变化。

1232免疫组织化学技术检测肺中ERK1/2及气道中转化生长因子（TGF）β蛋白的表达检测步骤按说明书进行，依次为肺组织石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复，冷却后用磷酸缓冲盐溶液（PBS）（pH74）洗涤，置于H2O2溶液（3%）中避光室温孵育，用PBS洗涤以消除内源性过氧化物酶活性。切片甩干，滴加牛血清白蛋白（BSA）（3%）后室溫封闭10 min，PBS洗涤，滴加一抗，孵育后再滴加二抗，PBS洗涤，洗涤，显色，复染细胞核，DW洗涤后脱水封片。

1233气道组织ERK1/2 mRNA表达的检测用于实时PCR实验的引物序列如下表1所示。

取样品（剪取每组肺组织约30 mg）剪碎，冷冻研磨，用Trizol一步法提取总RNA，按相应试剂盒操作说明书进行逆转录。逆转录反应（37 ℃，30 min）；令逆转录酶失活（85 ℃，10 s）；95 ℃，30 s（预变性）；PCR反应（95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，共40个循环）；解离（95 ℃，15 s；60 ℃，60 s）；溶解曲线（65 ℃下30 s）。

实时PCR扩增后，确认融解及扩增曲线良好，运用△△ct法对数据进行统计分析。

13统计学方法采用SPSS 130统计软件进行分析，所有实验数据均以（±s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析，以P<005为差异有统计学意义。

2结果

21翘芩清肺剂对气道炎症及肺部病理变化的影响模型组肺泡间质明显增厚并伴随大量淋巴细胞浸润，支气管杯状细胞明显增殖，部分见脱落，固有层明显增厚并淋巴浸润明显，黏膜层明显增厚并纤维化，可见部分黏液腺增生；血管黏膜层纤维性增生；血管支气管管腔中可见黏液渗出形成黏液栓。各药物干预组固有层增厚程度较轻，黏膜层增厚较模型组减轻。其中，地塞米松组支气管结构完整，管径正常，管壁细胞排列紊乱，管周有少量炎性反应细胞浸润，上皮细胞及杯状细胞增殖减少；翘芩清肺剂组支气管黏膜上皮细胞及杯状细胞的增殖减少，支气管稍变形，炎性反应细胞浸润明显减少，管壁及平滑肌厚度明显减小，以上改变随翘芩清肺剂剂量的加大而减轻。对照组肺组织形态结构清晰完整，气管杯状细胞无明显增殖及脱落，血管结构完整，周围无明显炎性反应细胞浸润。见图1AE。

22翘芩清肺剂对支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL4、IL5及IFNγ水平的影响与对照组比较，模型组BALF中IL4、IL5的表达水平明显增加，IFNγ表达水平明显下降（P<005）。与模型组比较，经药物干预后，各药物组均能显著降低IL4的表达及IL4/IFNγ的比值（P<005）。其中，翘芩清肺剂降低IL4表达的作用随着剂量加大而增强。翘芩清肺剂高剂量组及地塞米松组均可明显降低IL5水平（P<005），IFNγ水平增加（P<005），但翘芩清肺剂低剂量组则对其无明显影响（P>005）。见表2。

组织中的pERK1/2及气道组织中TGFβ1的蛋白表达明显增高（P<005）；地塞米松组相对于模型组肺组织中pERK1/2的蛋白表达显著下降（P<0005）；翘芩组相对于模型组pERK1/2蛋白表达均有下降趋势，但差异无统计学意义（P>005）。药物组中的TGFβ1蛋白表达均有明显降低（P<005）；翘芩组降低TGFβ1蛋白表达的作用略优于地塞米松组，且随剂量的增加作用有所增大，但药物组间差异无统计学意义（P>005）。见图2、3（AE）、表3。

34翘芩清肺剂对气道组织中ERK1/2 mRNA表达的影响与对照组比较，模型组的ERK1/2 mRNA含量显著增多（P<005）；与模型组比较，各药物组均能明显降差异低ERK1/2 mRNA的表达（P<005）；其中以翘芩高剂量组作用为最优，与翘芩低剂量组比较，差异有统计学意义（P<005）。见图4。

3讨论

哮喘是由多种炎性反应递质和多种炎性反应细胞参与的慢性气道炎症，有研究者认为，气道重塑可能与气道炎症并存，并进一步导致慢性炎症的发生和持续存在[5]，其中气道平滑肌细胞增殖肥大占有重要地位。TGFβ1是目前发现的活性最强的促气道纤维化因子，气道平滑肌在TGFβ1的刺激下，可诱发细胞炎性反应递质高分泌及收缩蛋白合成增加等，进而出现气道重塑、气道高反应性等一系列表现[67]。在哮喘发病过程中，以TGFβ为代表的细胞因子表达紊乱，从而激活相关信号通路，影响细胞的屏障功能是哮喘重要的病理机制之一，也是导致随后发生的气道高反应性、气道重塑的一个重要环节。

目前发现ERK在气道平滑肌上广泛分布并主要以ERK1、ERK2 2种亚型存在。ERK1/2的磷酸化表示ERK信号通路被激活，其磷酸化的一系列底物可激活多种效应蛋白，并广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生理病理过程。研究结果表明ERK通路与哮喘发病机制过程密切相关，并参与了哮喘气道高反应性、气道慢性炎症等的发生、发展[12]。据此，本实验我们观察了翘芩清肺剂对ERK通路的影响，以期探讨翘芩清肺剂改善哮喘气道炎性反应可能的作用机制。

翘芩清肺剂为我院临床应用20余年的院内纯中药复方制剂，疗效确切，无明显不良反应。方中主要成分为连翘、黄芩、板蓝根、荆芥、杏仁等，全方清肺化痰，疏风清热。目前我们研究已证实，翘芩清肺剂对OVA诱导的大鼠哮喘发作具有抑制作用，可与临床疗效相印证。研究结果显示，翘芩清肺剂可明显地改善气道炎性反应，减轻支气管细胞增殖及平滑肌增厚，其作用机制可能与降低哮喘时过高的PAF与ET表达，纠正了Th1/Th2失衡有关[67]。

从本实验结果可见，相对于对照组，ERK1/2、TGFβ1蛋白的表达、BALF液中的IL4、IL5表达在模型组中显著增高，IFNγ表达则明显降低；用药后，各药物组均能明显降低病鼠肺中ERK1/2 mRNA及气道中TGFβ1的表达水平；其中翘芩清肺剂高剂量组、翘芩清肺剂低剂量组降低ERK1/2 mRNA及TGFβ1表达的作用与地塞米松组相当；翘芩清肺剂低剂量组降低TGFβ1的蛋白表达效果与高剂量组相当。各药物组均能降低IL4的含量及IL4/IFNγ的比值。其中地塞米松组及翘芩清肺剂高剂量组可明显降低IL5的表达，增加IFNγ的表达，而翘芩清肺剂低剂量组对其则无明显作用。

其中，ERK的气道表达的放免及PCR结果表明，翘芩清肺剂可明显降低ERK mRNA的表达，而放免结果虽ERK的蛋白表达均有所下降，但比较无统计学意义。由此推测，翘芩清肺剂可显著抑制ERK1/2 mRNA复制和（或）DNA转录，而ERK的蛋白合成因迟于RNA和DNA的复制和转录，故未见ERK蛋白表达的差异显著性。由此说明，拟观察翘芩清肺剂对哮喘ERK蛋白变化的影响，需要更长的时间。

综上所述，我们认为，翘芩清肺剂防治哮喘的作用可能是通过降低TGFβ1的表达，下调pERK1/2 mRNA水平，调节ERK信号通路的传导，减轻气道纤维化及气道平滑肌细胞的增殖，减缓炎性反应的发生发展等而实现的。

参考文献

[1]徐妍，张焕萍.TNFα对哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖及ERK1/2活性的影响[J].中国比较医学杂志，2009，19（7）：2328，后插6.

[2]石岩，孙萍.细胞外信号调节激酶通道与支气管哮喘的研究进展[J].实用临床医学，2013，14（7）：137139.

[3]Lee M，Kim S，Kwon OK，et al.Antiinflammatory and antiasthmatic effects of resveratrol，a polyphenolic stilbene，in a mouse model of allergic asthma[J].Int Immunopharmacol，2009，9（4）：418424.

[4]Sakaguchi S.Regulatory T cells：key controllers of immunologic selftolerance[J].Cell，2000，101（5）：455458.

[5]Bush A.How early do airway inflammation and remodeling occur？[J].Allergol Int，2008，57（1）：1119.

[6]韓超，齐春丽，潘竞锵，等.翘芩清肺剂对哮喘大鼠Th1/Th2细胞因子失衡的影响[J].中国现代应用药学杂志，2013，30（11）：11781182.

[7]韩超，齐春丽，潘竞锵，等.翘芩清肺剂对哮喘大鼠平喘作用与变态及血管活性因子关系的研究[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（4）：176179.

（2018-04-18收稿责任编辑：杨觉雄）