张玥 胡雲飞 高水练 鲁静 林金科

摘要：【目的】分析茶树修剪物还田方式对茶园土壤理化性质及细菌群落结构的影响，为茶园管理及施肥提供参考依据。【方法】采集种植茶树多年的土壤与茶树修剪物进行室内共培育，利用高通量测序技术和生物信息学方法分析其土壤特性及细菌群落丰富度、多样性和群落结构。【结果】茶树修剪物还田120 d后，可在一定程度上提高茶园土壤pH和有机碳、速效磷、微生物生物量碳含量及脱氢酶活性；相对于对照（CK）组，茶树修剪物深埋20～30 cm后可提高土壤pH 10.96%、有机碳含量43.51%、速效磷含量17.66%、脱氢酶活性59.89%及微生物生物量碳33.06%。相关性分析结果表明，pH与有机碳、速效磷、微生物生物量碳含量和脱氢酶活性间存在交互影响。茶树修剪物还田能提高土壤细菌群落丰富度，显著提高土壤细菌多样性（P<0.05）。同时，修剪物还田对土壤细菌属群落结构影响明显，对土壤中硝化细菌生长具有促进作用；以鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）为代表的纤维素分解性细菌为优势菌种。【结论】茶树修剪物采用深埋方式还田可有效改良茶园土壤的理化性质，增加其细菌多样性和菌落种类，提高其细菌群落活性，以深埋20～30 cm的效果更佳。

关键词： 茶树；修剪物；土壤；细菌群落；多样性

中图分类号： S571.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1596-07

0 引言

【研究意义】茶树修剪作为茶园生产管理中的一项重要技术措施，对茶叶品质和产量提升、病虫害防治等具有明显作用（王发国等，2003；Lakshmi et al.，2009）。土壤理化性质是评价土壤质量的重要指标，其中有机碳和氮等主要营养成分含量改变是限制土壤微生物活力的重要因素（李顺姬等，2010）。土壤微生物主要包括细菌、真菌和放线菌等，其中以细菌的种类和数量最多，细菌在土壤营养元素循环、有机物质形成和分解、土壤肥力保持和提高、生态环境改善、植物生长发育和作物病虫害防治等方面均发挥着极其重要的作用（Kennedy，1999；贾辉等，2016）。修剪物还田是土壤的一个自我施肥过程，但在目前的茶园生产管理中，大量茶树修剪枝叶被直接废弃在茶园中，既造成资源浪费，又破坏土壤理化性质。因此，开展茶树修剪物还田对茶园土壤理化性质及细菌群落结构影响的研究，对茶园资源利用、茶园管理及环境改善具有重要意义。【前人研究进展】已有研究表明，茶树枯枝落叶的多酚类物质在土壤中积累，能促使土壤中有机碳积累、土壤碳氮比和土壤pH升高（Maudu et al.，2010）；对茶园土壤的N2O和CO2排放量也具有促进作用，且二者的排放量随凋落茶叶量的增加而增加（田亚男等，2016）；同时显著提高蔗糖酶和脲酶活性，增强土壤酶活性（Yuan et al.，2017）。Kardol和Wardle（2010）、朱留刚等（2017）研究认为，茶树修剪物可分解和释放养分，维持土壤肥力；茶园成龄后，中度或重度修剪可提高茶园生态水文功能。为加快茶树修剪物的利用，已有研究表明将其制成生物材料后还田能显著改良酸化茶园土壤的理化性质（杨平平，2012）、提高土壤脱氢酶活性、微生物生物量碳含量及微生物数量（胡雲飞等，2015a）。胡雲飞等（2015b）研究发现，在土壤中添加具有降解纤维素的真菌可加快茶园修剪物还田的降解速度。【本研究切入点】目前，关于茶树修剪物还田方式对茶园土壤性质及细菌群落结构影响的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】模拟茶树修剪物的不同还田方式，利用高通量测序技术分析其改善茶园土壤理化性质及细菌群落结构的影响机制，为茶园改造、茶树修剪物高效利用和茶园的可持续高产提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验地概况

选择江苏省苏州市东山镇10年生群体种茶园样地，采用五点取样法，除去表面枯枝落叶层和表土层，去除土壤中残留石块及其他杂质后采集土样，经风干、磨碎、过2 mm筛备用。参照鲍士旦（2005）的方法测定供试土壤性质：土壤质地为黄棕壤，pH 4.68，有机碳含量19.70 g/kg，全氮含量1.55 g/kg，速效磷含量35.40 mg/kg，交换性铝含量376.21 mg/kg。同时采集茶园中茶树修剪物，4 ℃保存备用。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 试验设计 参照Ruan等（2004）的方法设茶树修剪物深埋还田（BH组）和表面覆盖还田（ST组）两种方式，以不还田为对照（CK组），其中深埋还田深度为20～30 cm。修剪物还田前全部粉碎，还田量（修剪物/土）为10.0 g/kg（相当于常规茶园6年茶树落叶的还田量），每处理重复3次。每个塑料盆（上口径38 cm×高45 cm×底部直径28 cm）中添加10.0 kg供试土样，用封口膜密封留孔，用蒸馏水维持田间持水量55%～60%，于室温25 ℃培养120 d。培养结束后，每处理采集0～30 cm土壤，分别标记为BH1、BH2、BH3和ST1、ST2、ST3及CK1、CK2、CK3，一部分用于提取土壤微生物DNA，另一部分用于测定土壤理化性质。

1. 2. 2 土壤理化性质测定 参照鲍士旦（2005）的方法测定供试土壤性质，采用氯仿熏蒸提取法测定微生物生物量碳含量，参照Moeskops等（2010）的方法测定脱氢酶活性。

1. 2. 3 土壤微生物DNA提取 以改良SDS高盐缓冲液抽提法提取土壤微生物总DNA。对16S rDNA高变区V3+V4区进行测序，对原始数据进行拼接，将拼接得到的序列进行质量过滤，并去除嵌合体，即得到高质量的Tags序列（Edgar et al.，2011；Magoc and Salzberg，2011；Bolger et al.，2014）。

1. 3 統计分析

在相似性97%水平对序列进行聚类，以测序所有序列数0.005%为阈值过滤操纵分类单元（Operational taxonomic unit，OTU），采用Mothur version v.1.30分析阿尔法（α）指数（Chao1指数、Simpson指数和Shannon指数），并以SSPS 17.0进行单因素方差分析和相关性分析。

2 结果与分析

2. 1 茶园土壤的主要理化性状及酶活性变化情况

由表1可知，茶园土壤经120 d培育后，BH和ST处理组的pH均高于CK组，其中，BH处理组的pH与CK组差异显著（P<0.05，下同），ST处理组的pH与CK组无显著差异（P>0.05，下同）；ST处理组和CK组的pH均低于培育前的pH（4.68），BH处理组的pH高于培育前的pH。由表1还可看出，BH处理组的有机碳和速效磷含量均显著高于CK组，ST处理组的有机碳和速效磷含量与CK组差异不显著；BH和ST处理组的全氮含量高于CK组，但相互间差异不显著；BH和ST处理组的脱氢酶活性显著高于CK组，其中又以BH处理组最高；BH处理组的微生物生物量碳含量显著高于ST处理组和CK组。说明茶树修剪物深埋还田对茶园土壤理化性状的改良效果较佳。

2. 2 各土壤因子的相关性

由表2可知，pH、脱氢酶活性和微生物生物量碳含量三者间呈极显著正相关（P<0.01，下同），pH与有机碳含量、有机碳含量与速效磷含量也呈极显著正相关，速效磷含量与pH和脱氢酶活性呈显著正相关，全氮含量与有机碳、速效磷、微生物生物量碳含量及脱氢酶活性的相关性均不显著。说明茶叶修剪物还田后茶园土壤的pH、有机碳和速效磷含量及脱氢酶活性与微生物量碳含量间存在交互影响。

2. 3 茶园土壤细菌的多样性

由表3和图1可看出，各处理组的OTU个数排序为BH处理组>ST处理组>CK组，且相互间差异显著（表3）；在97%相似度水平下聚类共得到1718个OTUs（图1）；3个处理组共同的OTU为1019个，CK组特有的OTU为54个，BH处理组特有的OTU为177个，ST处理组特有的OTU为134个（图1），其中，BH和ST处理组特有的OTU数量多于CK组。在α多样性指数中，Chao1、Simpson和Shannon指数均指示土壤的细菌群落结构发生了明显变化（表3），其中，BH处理组的Chao1指数显著高于ST处理组和CK组，说明茶树修剪物深埋还田对土壤微生物总量增加的促进作用较明显；BH处理组的Simpson和Shannon指数最高，其中与ST处理组的Simpson指数差异显著，与CK组的Shannon指数差异显著。说明茶树修剪物还田可促使土壤细菌种群增多，提高物种丰富度，其中深埋还田效果更佳。

对3个处理组土壤细菌群落结构进行主成分分析（PCA），利用不同样本中的细菌类优势菌属进行制图，结果（图2）表明，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的贡献率（分别为39.97%和13.33%）之和为53.30%；在利用OTU构建的PCA因子载荷体系中，3个处理组分别坐落于坐标轴的不同区域，其中CK组分布在坐标轴PC1和PC2的负端，BH处理组分布在坐标轴PC1的正端和PC2的负端，ST处理组分布在坐标轴PC1和PC2的正端。说明3个处理组的细菌结构间存在明显差异。

将OTU代表序列与微生物参考数据库进行比对，获得OTU对应的物种分类信息，绘制样品属水平群落组成丰度图（图3）。从图3可看出，样品中所有未知菌类的相对丰度为66.7%～81.5%，其中CK3的未知菌丰度最高，ST1的未知菌丰度最低。对已知细菌进行种类分析（表4）发现，CK组的优势菌为热酸菌属（Acidothermus）、Bryobacter属、Candidatus solibacter属和副球菌属（Rhizomicrobium）；BH处理组的优势菌为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、C. solibacter属、副球菌属和Nitrospira属；ST处理组的优势菌为C. solibacter、鞘氨醇单胞菌属、Rhodanobacter属和副球菌属。说明在土壤中添加茶树修剪物后，以鞘氨醇单胞菌属等为代表的降解性细菌大量繁殖，并改变土壤细菌群落结构，具有硝化作用的Nitrospira属相对丰度也有明显提升，提高了土壤中的硝态氮含量，故而对土壤改良具有潜在的积极作用。

3 讨论

本研究结果显示，茶园修剪物采用深埋还田能显著提高茶园土壤pH，一定程度上提高茶园土壤肥力，对茶园土壤改良具有积极作用，与梁月荣等（2000）、王辉等（2009）的研究结果相似。可能一方面是由于茶树修剪物还田后降解时释放出有机酸阴离子（碱）（Yan et al.，1996），有效中和了土壤中的酸性物质，提高土壤pH，另一方面茶树修剪物中降解的腐殖质胶体成分使土壤化学分子与铝结合且腐烂分解释放出的铝是一种结合态铝，降低了土壤中交换性铝的含量，对茶园土壤pH的降低起到一定缓冲作用，进而影响土壤的理化性状。

在茶园管理过程中，茶树修剪物还田会导致土壤pH及全氮和有机碳含量等理化性质发生改变，而这些因子与土壤细菌群落结构存在密切联系。其中，土壤pH及全氮和有机碳含量的增加促使土壤菌群物种多样性呈增加趋势；当土壤样品间的pH接近时，全氮含量变化与菌群物种多样性具有同步效应，同时土壤有机碳含量与土壤细菌群落丰富度指数和Chao1指数具有关联性（Shen et al.，2013）；当土壤微生物群落结构发生改变时导致土壤脱氢酶活性发生改变，而土壤脱氢酶作为一种胞内酶，直接参与微生物呼吸过程的氧化磷酸化过程（Moeskops et al.，2010）。本研究发现，茶树修剪物还田后能有效提升土壤脱氢酶活性及微生物生物量碳含量，二者与土壤pH和有机质含量呈显著正相關，其中深埋还田方式效果更显著，从而影响土壤细菌群落结构的变化；茶树修剪物还田对土壤细菌多样性及菌落种类的增加也有一定促进作用，以鞘氨醇单胞菌属为代表、具有降解作用的功能性细菌在土壤中大量繁殖，主要具有促进植物生长、降解有机质及修复植物重金属污染等作用（Myresiotis et al.，2012；Chen et al.，2014）。可见，茶树修剪物还田可改变茶园土壤细菌群落结构，进一步影响茶树修剪物的降解，二者间存在一定程度的反馈调节作用，但具体的反馈调控机理有待进一步探究。

茶园土壤中细菌数量和群落多样性的变化除受土壤中理化性质的直接影响外，还与茶园施肥和种植年限等因素有关。此外，茶树枯枝落叶、修剪物的降解产物及降解过程中某些抑制物质的产生，均是引起土壤细菌群落发生改变的重要因素，但这些因素对土壤细菌群落的影响机制及对茶树生长的影响程度均有待进一步探讨。

4 结论

茶园修剪物采用深埋20～30 cm还田能显著提高茶园土壤pH，一定程度上提高茶园土壤肥力，对茶园土壤改良具有积极作用。同时，可有效提升土壤脱氢酶活性及微生物生物量碳含量，对土壤细菌多样性及菌落种类的增加也有一定促进作用。

参考文献：

鲍士旦. 2005. 土壤农化分析[M]. 北京：中国农业出版社. [Bao S D. 2005. Soil and Agro-chemical Analysis[M]. Beijing：China Agriculture Press.]

侯爱月，李军，卞伟，王盟，郑林雪，张彦灼，赵昕燕. 2016. 不同短程硝化系统中微生物群落结构的对比分析[J]. 中国环境科学，36（2）：428-436. [Hou A Y，Li J，Bian W，Wang M，Zheng L X，Zhang Y Z，Zhao X Y. 2016. Analysis of microbial community structure in different partial nitrification system[J]. China Environmental Science，36（2）：428-436.]

胡雲飛，李荣林，杨亦扬，张玥，黎星辉. 2015a. 内生真菌短密木霉对茶树修剪叶降解及土壤真菌的影响[J]. 生态学杂志，34（3）：820-825. [Hu Y F，Li R L，Yang Y Y，Zhang Y，Li X H. 2015a. Effects of endophytic fungus（Trichoderma brevicompactum） on the decomposition of pruned tea leaves and soil fungi[J]. Chinese Journal of Ecology，34（3）：820-825.]

胡雲飞，李荣林，杨亦扬. 2015b. 生物炭对茶园土壤CO2和N2O排放量及微生物特性的影响[J]. 应用生态学报，26（7）：1954-1960. [Hu Y F，Li R L，Yang Y Y. 2015b. E-ffects of biochar on CO2 and N2O emissions and microbial properties of tea garden soils[J]. Chinese Journal of App-lied Ecology，26（7）：1954-1960.]

贾辉，陈秀蓉，芦光新，孔雅丽，杨成德. 2016. 纤维素降解细菌的筛选、生物学特性及降解效果[J]. 草业学报，25（3）：60-66. [Jia H，Chen X R，Lu G X，Kong Y L，Yang C D. 2016. Isolation of cellulose-degrading bacteria and determination of their degradation activity[J]. Acta Prataculturae Sinica，25（3）：60-66.]

李顺姬，邱莉萍，张兴昌. 2010. 黄土高原土壤有机碳矿化及其与土壤理化性质的关系[J]. 生态学报，30（5）：1217-1226. [Li S J，Qiu L P，Zhang X C. 2010. Mineralization of soil organic carbon and its relations with soil physical and chemical properties on the Loess Plateau[J]. Acta Ecologica Sinica，30（5）：1217-1226.]

李燕妮. 2013. 细菌菌群降解石油的影响因素及应用研究[D]. 天津：天津理工大学. [Li Y N. 2013. Bacterial consortium characteristics and applied research on oil degradation[D]. Tianjing：Tianjing University of Technology.]

梁月荣，赵启泉，陆建良，刘祖生. 2000. 茶树修剪物和不同氮肥对土壤pH和活性铝含量的影响[J]. 茶叶，26（4）：205-208. [Liang Y R，Zhao Q Q，Lu J L，Liu Z S. 2000. E-ffect of pruned tea leaf and various nitrogen fertilizers on soil pH and activated aluminum content[J]. Journal of Tea，26（4）：205-208.]

刘莹，王丽华，郝春博，李璐，李思远，冯传平. 2014. 酸性矿山废水库周边土壤微生物多样性及氨氧化菌群落研究[J]. 环境科学，35（6）：2306-2313. [Liu Y，Wang L H，Hao C B，Li L，Li S Y，Feng C P. 2014. Microbial diversity and ammonia-oxidizing microorganism of a soil sample near an acid mine drainage lake[J]. Environmental Science，35（6）：2306-2313.]

唐慶华，朱辉，覃伟权. 2014. 洋葱伯克氏菌致病因子的研究进展[J]. 微生物学报，54（5）：487-497. [Tang Q H，Zhu H，Qin W Q. 2014. Advances in virulence determinants in Burkholderia cepacia complex：A review[J]. Acta Microbiologica Sinica，54（5）：487-497.]

田亚男，何志龙，吕昭琪，夏文建，林杉. 2016. 凋落茶叶对华中地区酸化茶园土壤N2O与CO2排放的影响[J]. 农业环境科学学报，35（8）：1625-1632. [Tian Y N，He Z L，Lü Z Q，Xia W J，Lin S. 2016. Effects of tea litter applications on N2O and CO2 fluxes from acidification of tea garden soil in Central China[J]. Journal of Agro-Environment Science，35（8）：1625-1632.]

王发国，叶华谷，陈玉琼. 2003. 茶树修剪时期和程度对早市名优茶品质的影响[J]. 经济林研究，21（2）：16-18. [Wang F G，Ye H G，Chen Y Q. 2003. Effect of pruning date and degree on early marketed famous tea quality[J]. Economic Forest Researches，21（2）：16-18.]

王辉，王宁，徐仁扣，黎星辉. 2009. 茶树叶和刺槐叶对茶园土壤酸度的改良效果[J]. 农业环境科学学报，28（8）：1597-1601. [Wang H，Wang N，Xu R K，Li X H. 2009. Amelioration effect of tea tree leaves and acacia leaves on the acidity of tea garden soils[J]. Journal of Agro-Environment Science，28（8）：1597-1601.]

杨平平. 2012. 茶树修剪物及其生物质炭还田的土壤环境效应[D]. 南京：南京农业大学. [Yang P P. 2012. The soil effects of tea garden clippings and their biochars[D]. Nanjing：Nanjing Agriculture University.]

朱留刚，孙君，张文锦，陈芝芝. 2017. 修剪对茶树修剪凋落物水文特性的影响[J]. 南方农业学报，48（10）：1795-1801. [Zhu L G，Sun J，Zhang W J，Chen Z Z. 2017. Effects of pruning on hydrological characteristics of tea tree litter[J]. Journal of Southern Agriculture，48（10）：1795-1801.]

Bolger A M，Lohse M，Usadel B T. 2014. Trimmomatic a fle-xible trimmer for Illumina sequence data[J]. Bioinforma-tics，30（15）：2114-2120.

Chen B，Shen J G，Zhang X C，Pan F S，Yang X E，Feng Y. 2014. The endophytic bacterium，Sphingomonas SaMR12，improves the potential for Zinc phytoremediation by its host，Sedum alfredii[J]. PLoS One，9（9）：e106826.

Edgar R C，Haas B J，Clemente J C，Quince C，Knight R. 2011. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J]. Bioinformatics，27（16）：2194-2200.

Kardol P，Wardle D A. 2010. How understanding aboveground-belowground linkages can assist restoration ecology[J]. Trands in Ecology and Evolution，25（11）：670-679.

Kennedy A C. 1999. Bacterial diversity in agro ecosystems[J]. Agric Ecosyst & Environ，74（1-3）：65-76.

Lakshmi K H，Mantu B，Budhindra N H. 2009. Insect pests of tea and their management[J]. Annual Review of Entomology，（54）：267-284.

Luo Y F，Xu X L，Ding Z H，Liu Z，Zhang B，Yan Z Y，Sun J，Hu S N，Hu X. 2008. Complete genome of Phenylobacterium zucineum—A novel facultative intracellular bacterium isolated from human erythroleukemia cell line K562[J]. BMC Genomics，9：386.

Magoc T，Salzberg S L. 2011. FLASH：Fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies[J]. Bioinformatics，27（21）：2957-2963.

Maudu M，Mudau F N，Mariga I K. 2010. The effect of pru-ning on growth and chemical composition of cultivated bush tea（Athrixia phylicoides D.C）[J]. Journal of Medi-cinal Plants Research，4（22）：2353-2358.

Moeskops B，Sukristiyonubowo，David B，Sleutel S，Lenita H，Edi H，Rasti S，Diah S，Stefaan D N. 2010. Soil microbial communities and activities under intensive organic and conventional vegetable farming in West Java，Indonesia[J]. Applied Soil Ecology，45（2）：112-120.

Myresiotis C，Vryzas Z，Papadopouloumourkidou E. 2012. Biodegradation of soil-applied pesticides by selected strains of plant growth-promoting rhizobacteria（PGPR） and their effects on bacterial growth[J]. Biodegradation，23（2）：297-310.

Ruan J Y，Ma L F，Shi Y Z，Zhang F S. 2004. Effects of litter incorporation and nitrogen fertilization on the contents of extractable aluminium in the rhizosphere soil of tea plant（Camallia sinensis（L.） O. Kuntze）[J]. Plant and Soil，263（1）：283-296.

Shen C C，Xiong J B，Zhang H Y，Feng Y Z，Lin X G，Li X Y，Liang W J，Chu H Y. 2013. Soil pH drives the spatial distribution of bacterial communities along elevation on Changbai Mountain[J]. Soil Biology and Biochemistry，57：204-211.

Ward N L，Challacombe J F，Janssen P H，Henrissat B，Coutinho P M，Wu M，Xie G，Haft D H，Sait M，Badger J，Barabote R D，Bradley B，Brettin T S，Brinkac L M，Bruce D，Creasy T，Daugherty S C，Davidsen T M，DeBoy R T，Detter J C，Dodson R J，Scott Durkin A，Gana-pathy A，Gwinn-Giglio M，Han C F，Khouri H，Kiss H，Kothari S P，Madupu R，Nelson K E，Nelson W C，Paulsen I，Penn K，Ren Q H，Rosovitz M J，Selengut J D，Shrivastava S，Sullivan S A，Tapia R，Thompson R S，Watkins K L，Yang Q，Yu C H，Zafar N，Zhou L W，Kuske C R. 2009. Three genomes from the phylum Acidobacteria provide insight into the lifestyles of these microorganisms in soils[J]. Applied and Environmental Microbiology，75（7）：2046-2055.

Yan F，Schubert S，Mengel K. 1996. Soil pH increase due to biological decarboxylation of organic anions[J]. Soil Bio-logy and Biochemistry，28（4-5）：617-624.

Yuan S Y，Zhang N，Wu X F，Qian Y F，Chen X，Raza W，Li X H. 2017. Effect of pruned material，extracts，and polyphenols of tea on enzyme activities and microbial community structure in soil[J]. Soil Science and Plant Nutrition，63（6）：607-615.

（責任编辑 思利华）