黄旭华 汤庆坤 罗梅兰 黄深惠 蒋师东 夏青 黄景滩 李安华 鲁成 陈小青 毛洪斌 潘志新

摘要：【目的】全面掌握广西昆虫微孢子虫资源及其分布情况，并进行感染性和分类研究，为经济昆虫微孢子虫病的防控提供参考依据。【方法】通过人工捕捉或诱虫灯引诱方式在广西蚕区的桑园、菜地及周围收集野外昆虫，显微镜检验各种野外昆虫微孢子虫的自然感染率；通过生物试验鉴定部分野外昆虫微孢子虫对家蚕的食下感染性，并分别检测桑尺蠖微孢子虫和菜粉蝶微孢子虫对原始寄主的胚种传染性；基于SSU rRNA序列构建昆虫微孢子虫系统发育进化树，明确昆虫微孢子虫的分类特征。【结果】广西昆虫微孢子虫资源分布广泛，大部分昆虫已感染微孢子虫，其中菜粉蝶、稻纵卷叶螟、桑螟、桑尺蠖、斜纹夜蛾和红腹灯蛾的微孢子虫自然感染率分别为54.95%、4.38%、0.08%、0.28%、0.64%和1.14%，其他鳞翅目昆虫的总体微孢子虫感染率为0.75%。部分昆虫微孢子虫可食下感染家蚕，交叉感染率达40.00%；部分昆虫微孢子虫还具有很强的胚种传染力，其中桑尺蠖微孢子虫和菜粉蝶微孢子虫对原始寄主的胚种传染率分别为77.48%和66.15%。从桑尺蠖分离获得的3株微孢子虫虽然为不同的微孢子虫，但均属于Nosema属，与家蚕微孢子虫同属异种。【结论】在广西各地区存在丰富的昆虫微孢子虫资源，种类多样，且大部分昆虫微孢子虫属于Nosema属，与家蚕微孢子虫亲缘关系密切；部分野外昆虫微孢子虫还对家蚕形成交叉传染危害的风险，因此杜绝昆虫微孢子虫污染桑叶交叉感染家蚕是控制家蚕微粒子病发生的重要措施。

关键词： 昆虫微孢子虫；资源分布；感染性；分类特征

中图分类号： S884.21 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1541-07

0 引言

【研究意义】昆虫是自然界中种类、数量最多的生物，约占地球上所有生物物种的50%以上（张茂林和王戎疆，2011），而微孢子虫（Microsporidian）是一种嗜昆虫的病原微生物，几乎整个昆虫纲的昆虫均能被微孢子虫寄生，尤其以鳞翅目和双翅目昆虫最常见，且大多数昆虫种类中至少可寄生一种以上微孢子虫（刘吉平和曾玲，2006）。微孢子虫病一方面影响野外昆虫种群的自然平衡，另一方面对家蚕、柞蚕等经济和资源昆虫造成严重危害（梁喜丽等，2018）。因此，开展野外昆虫微孢子虫资源调查，对控制经济昆虫微粒子病发生和了解自然界昆虫害虫种群自我调节规律具有重要意义，也有利于筛选出优质昆虫微孢子虫作为农业生物防治素材以促进生物防治新方法的推广应用。【前人研究进展】昆虫微孢子虫是一类重要的病原微生物，至今发现的微孢子虫已超过200属1300～1500种，可侵染双翅目和鳞翅目昆虫的在400种以上（梁喜丽等，2018）。长期以来，为了充分了解野外昆虫微孢子虫对家蚕的交叉传染性，1967～1979年日本学者广濑安春等曾在日本蚕区桑园收集102种昆虫（约25000头），经检验发现65种昆虫存在微孢子虫感染，其中从12种昆虫体内分离获得的微孢子虫对家蚕具有感染力（周泽扬等，2014）；国内学者郑祥明等（2003）也于1995～1998年在广东蚕区桑园、菜地及蚕房附近收集野外昆虫共389种（约20000头），检验发现在51种昆虫中存在54种微孢子虫，其中18种可经口感染家蚕；黄旭华等（2010）于2007～2009年在广西蚕区收集野外昆虫约9000头，初步查找出一些能感染微孢子虫的野外昆虫种类。此外，为充分了解微孢子虫对昆虫的危害性，已有学者对某些种类昆虫进行微孢子虫感染率调查。王容燕等（2008）于1998～2003年在河北省调查棉铃虫微孢子虫病的发生情况，发现田间棉铃虫微孢子虫病呈流行趋势，第4代幼虫微孢子虫感染率达49.0%，且微孢子虫对棉铃虫致病力极强；Fürst等（2014）在英格兰马恩岛设点调查家养蜜蜂与野外熊蜂的微孢子蟲和病毒发生率，发现存在家养蜜蜂传染微孢子虫和变形翼病毒给野生熊蜂的风险，进而危害作物授粉蜂群密度，造成全球作物授粉效率降低，最终影响全球食物产量。【本研究切入点】近年利用昆虫微孢子虫作为生物农药防治农业和林业害虫已成为研究热点。据报道，在我国新疆、内蒙古、青海、甘肃等地使用过蝗虫微孢子虫的草场，近十年均未再度暴发大面积的蝗灾（石旺鹏和季荣，2017）。广西地处亚热带地区，气候高温多湿，有利于植物生长的同时有利于众多昆虫种类繁殖，且广西是我国蚕业生产规模第一大省（区），桑树种植面积逐年扩大，害虫繁多，但目前尚无针对广西昆虫微孢子虫资源的系统报道。【拟解决的关键问题】在广西蚕区的桑园、菜地及其周围收集野外昆虫进行检验，旨在全面掌握广西昆虫微孢子虫资源及其分布情况，并进行感染性和分类研究，为经济昆虫微孢子虫病的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试家蚕品种为932×芙蓉。野外昆虫分别收集于广西南宁市石埠镇、武鸣区和广西蚕业技术推广站、柳州市柳江县、河池市宜州区和南丹县、百色市德保县、贵港市港北区及崇左市扶绥县。

1. 2 昆虫微孢子虫自然感染率调查

2014～2017年在各调查点的桑园及其周围通过人工捕捉或诱虫灯引诱方式捕捉各种野外昆虫，对收集的昆虫进行分类鉴定后逐只研磨镜检或集团研磨镜检，判定是否感染微孢子虫，然后统计各种野外昆虫微孢子虫的自然感染率。

1. 3 昆虫微孢子虫感染力调查

1. 3. 1 部分昆虫微孢子虫对家蚕的病原性 收集部分昆虫微孢子虫，参照黄少康和鲁兴萌（2004）的方法进行分离纯化。将各纯化昆虫微孢子虫配制成1.0×106个/mL的孢子悬液，再分别取各种孢子悬液0.2 mL，涂抹于2张面积8 cm2的桑叶上，饲喂30头2龄起蚕。待蚕儿吃尽带毒桑叶后，以经漂白粉精溶液（含0.5%有效氯）浸泡消毒10 min的洁净桑叶饲养至5龄第2 d，对所有蚕儿逐头研磨镜检，调查各昆虫微孢子虫对家蚕的感染情况（罗梅兰等，2012）。

1. 3. 2 部分昆蟲微孢子虫的胚种传染率调查 将桑尺蠖微孢子虫（Microsporidan isolated from Phtho-nandria atrilineata Butler，PaBM1）配制成1.0×106个/mL的孢子悬液，再将洁净桑叶片浸泡于孢子悬液中，取出稍微晾干，饲喂桑尺蠖3龄幼虫，连续攻毒12 h后改用经漂白粉精溶液（含0.5%有效氯）浸泡消毒10 min的洁净桑叶饲养至化蛹，经化蛾、交配和产卵后，检验桑尺蠖成虫是否有微粒子孢子，收集3个卵块，分别孵化出桑尺蠖幼虫；分区利用叶面消毒桑叶饲喂桑尺蠖幼虫3 d，再逐只检验，调查桑尺蠖微孢子虫对桑尺蠖的胚种传染率。同时，在菜地调查菜粉蝶幼虫（菜青虫）的危害情况，收集3窝未散开的菜青虫，逐只研磨镜检携带微孢子虫情况，调查菜粉蝶微孢子虫的胚种传染率。

1. 4 部分昆虫微孢子虫分子系统发育进化分析

1. 4. 1 基因组DNA提取 参照刘吉平等（2004）、罗梅兰等（2012）的方法，采用CTAB法抽提微孢子虫基因组DNA。

1. 4. 2 SSU rRNA序列PCR扩增及测序分析 参照Huang等（2014）的方法选取引物18f（5'-CACCAGGTTGATTCTGCC-3'）和1537r（5'-TTATGATCCTCCTAATGGTTC-3'），再依据黄旭华等（2012）的方法PCR扩增微孢子虫SSU rRNA序列，回收目的条带DNA后分别进行克隆。将各种微孢子虫SSU rRNA序列的克隆产物送至上海立菲生物技术有限公司进行测序。

1. 4. 3 系统发育进化树构建 参照董世楠等（2009）的方法，将测序得到的微孢子虫SSU rRNA序列与GenBank中的10种不同种属微孢子虫进行同源性比对分析，并构建系统发育进化树；同时对各种微孢子虫SSU rRNA序列进行相似度和遗传距离（分化度）分析。

2 结果与分析

2. 1 广西昆虫微孢子虫资源分布情况

2014～2017年，先后从桂南（南宁市、崇左市）、桂中（柳州市）、桂东（贵港市）、桂西（百色市）和桂北（河池市）等蚕区的桑园、菜地及其周围收集野外昆虫，主要是鳞翅目昆虫及少量鞘翅目昆虫，其种类有桑园内的桑螟、桑尺蠖、斜纹夜蛾、桑毛虫、红腹灯蛾、桑天牛和桑兰叶甲及桑园周围的菜粉蝶、稻纵卷叶螟和草螟等。4年期间共收集野外昆虫5万多头，检验发现携带微孢子虫孢子的昆虫有368头，总感染率为0.70%，其中2014、2015、2016和2017年分别收集昆虫6361、5501、22933和17569头，对应的微孢子虫自然感染率为1.13%、1.62%、0.34%和0.73%。大部分野外昆虫种类均存在一定的微孢子虫感染情况，且差异明显（表1）。在所有收集的昆虫中，以菜粉蝶微孢子虫感染率最高，达54.95%，其次是稻纵卷叶螟（4.38%），桑园外其他鳞翅目昆虫微孢子虫感染率为0.75%；桑园内主要昆虫桑螟、桑尺蠖、斜纹夜蛾和红腹灯蛾的微孢子虫自然感染率分别为0.08%、0.28%、0.64%和1.14%，桑毛虫、桑天牛、桑兰叶甲和草螟等未检出微孢子虫，可能是收集调查的昆虫数量较少。从区域分布来看，桂南、桂中、桂东、桂西和桂北的野外昆虫微孢子虫自然感染率分别为0.75%、0.50%、0.53%、0.38%和0.51%（表2），其中桂南地区的昆虫微孢子虫感染率较其他地区偏高，是由于该地区的菜粉蝶和稻纵卷叶螟微孢子虫自然感染率较高所致。可见，广西昆虫微孢子虫资源分布范围广，大部分昆虫均已感染微孢子虫，且呈现出桑园外昆虫微孢子虫自然感染率比桑园内昆虫高的现象。

2. 2 野外昆虫微孢子虫对家蚕的感染性

共测定65株昆虫微孢子虫对家蚕的食下感染性，结果发现有26株昆虫微孢子虫可食下感染家蚕（表3），对家蚕的交叉感染率达40.00%，进一步证实野外昆虫微孢子虫对家蚕具有交叉传染性，而野外昆虫是家蚕微粒子病发生的重要传染源。

2. 3 野外昆虫微孢子虫的胚种传染性

微孢子虫胚种传染是危害寄主的重要方式。由表4可看出，桑尺蠖微孢子虫对桑尺蠖寄主的平均胚种传染率达77.48%，说明具有很强的胚种传染力。田间调查发现，菜粉蝶微孢子虫对菜青虫（菜粉蝶）的平均胚种传染率达66.15%（表4），说明也具有很强的胚种传染力。

2. 4 桑尺蠖微孢子虫SSU rRNA序列分析结果

经PCR扩增和测序分析，获得3株桑尺蠖微孢子虫（PaBM3、PaBM5和PaBM6）的SSU rRNA序列，长度为1100～1300 bp，与预期结果相符。将测序获得的微孢子虫SSU rRNA序列与GenBank中的10种不同种属微孢子虫进行同源性比对分析，结果发现3株桑尺蠖微孢子虫间的相似度为98.9%～99.9%、分化度为0.1～0.3（图1），与已知微孢子虫间的相似度（37.3%～99.9%）和分化度（0.1～54.5）存在明显差异，初步推测这3株桑尺蠖微孢子虫为不同的微孢子虫。基于微孢子虫SSU rRNA序列构建系统发育进化树，发现获得的3株桑尺蠖微孢子虫均位于Nosema属类群中（图2），即3株桑尺蠖微孢子虫虽然为不同的微孢子虫，但均属于Nosema属。

3 讨论

微孢子虫是一类专营细胞内寄生的原生动物，能感染从原生生物到人类的几乎所有动物（Winters and Faisai，2014），是许多昆虫、鱼类、兔类、皮毛动物、啮齿类及灵长类动物的重要病原，是引发人畜腹泻的主要病原（邱璐瑶等，2017；李东方等，2018），也是虾、蟹等水产动物的致死病原微生物（赵彦华等，2017）。为充分了解自然界昆虫中的微孢子虫流行规律，本研究调查了广西昆虫微孢子虫资源分布情况，并分析昆虫微孢子虫的感染性和分类特性，结果表明，广西昆虫微孢子虫资源分布广泛，大部分鳞翅目昆虫存在微孢子虫感染情况，且部分昆虫微孢子虫对寄主具有很强的胚种传染性（桑尺蠖微孢子虫和菜粉蝶微孢子虫），说明可能存在微孢子虫与昆虫宿主共生或控制昆虫自然种群密度的现象。此外，各种野外昆虫的微孢子虫自然感染率存在明显差异，如菜粉蝶的微孢子虫感染率达54.94%，而桑螟的微孢子虫感染率仅0.08%，二者相差600多倍，说明自然界中存在易感微孢子虫的特定昆虫寄主，今后可从这些易感昆虫收集微孢子虫资源。

已有研究证实，昆虫微孢子虫可来源于Nosema sp.、Vairimorpha sp.、Thelophania sp.、Pleistophora sp.或Endoreticulatus sp.等不同属。时连根等（1999）从桑尺蠖分离出1株Thelophania属微孢子虫，方定坚等（2002）从桑兰叶甲分离出1株Vairimorpha属微孢子虫，万永继等（2005）从龙眼裳卷蛾分离出1株Vairimorpha属微孢子虫，杨琼等（2007）从甜菜夜蛾分离出1株Nosema属微孢子虫；本课题组前期调查也发现，从7种昆虫分离获得的微孢子虫均属于Nosema属（黄旭华等，2012，2013）。本研究结果表明，从桑尺蠖分离获得的3株微孢子虫虽然为不同的微孢子虫，但均属于Nosema属，与家蚕微孢子虫同属异种。此外，本研究通过生物试验鉴定昆虫微孢子虫对家蚕的感染力，发现有26株昆虫微孢子虫可食下感染家蚕，对家蚕的交叉感染率达40.00%。Kawarabata（2003）也曾报道昆虫微孢子虫可通过鳞毛、蛾液、病虫尸体等载体在自然界扩散传播并感染新寄主。可见，广西蚕区已存在野外昆虫微孢子虫交叉传染家蚕的现象，尤其是菜粉蝶、稻纵卷叶螟、桑螟等昆虫具有与家蚕交叉感染微孢子虫的风险，即杜绝昆虫微孢子虫污染桑叶交叉感染家蚕是控制家蚕微粒子病发生的重要措施。

4 结论

在广西各地区存在丰富的昆虫微孢子虫资源，种类多样，且大部分昆虫微孢子虫属于Nosema属，与家蚕微孢子虫亲缘关系密切；部分野外昆虫微孢子虫还对家蚕形成交叉传染危害的风险，因此杜绝昆虫微孢子虫污染桑叶交叉感染家蚕是控制家蚕微粒子病发生的重要措施。

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（责任编辑 兰宗宝）