陈曙 赵秋芳 陈宏良 贾利强

摘要：【目的】利用生物信息学分析玉米泛素结合酶（E2）基因家族的理化性质和功能，并研究低磷处理下泛素E2基因在玉米幼苗不同组织部位的表达情况，为深入研究泛素E2基因响应低磷胁迫的分子机制提供理论参考。【方法】以MEGA 6.0邻接法（NJ）构建拟南芥、水稻和玉米E2基因家族成员的系统发育进化树，利用生物信息学方法对75个玉米E2基因进行序列分析及理化性质预测。对玉米幼苗进行低磷处理，分别在0、1、6和24 h时采集其根部和叶片样品，并分别通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其E2亚家族XVIII成员基因即ZmUBC17、ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和ZmUBC58在玉米幼苗不同组织中的表达情况。【结果】拟南芥、水稻和玉米的E2基因可划分为18个亚家族，各亚家族间基因功能和进化关系较相近，但含有的E2基因数量差异明显，以亚家族VI的成员最多，亚家族X、XII和XV的成员数最少，均为3个，各亚家族中均分别含拟南芥、水稻和玉米E2基因各1个。玉米E2基因的编码区序列（CDS）长度为402～2616 bp，编码133～871个氨基酸，外显子数目数量存在明显差异，以4～6个居多，最少为1个，最多为12个。86.8%的玉米E2蛋白为不稳定蛋白。玉米E2亚家族XVIII成员中，ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和ZmUBC58蛋白UBC结构域序列具有高度相似性，但与ZmUBC17存在明显差异，且这4个基因在玉米根和叶中均有表达，基因表达模式相似，整体上在低磷处理6 h时的表达量最高；低磷处理下ZmUBC17基因在根中不同时间点的表达量变幅较小，但在叶0～24 h时的表达量呈逐渐升高的变化趋势，尤其是24 h时表达量达最高，表明ZmUBC17基因的响应部位是叶片。【结论】玉米泛素E2蛋白可能参与调控对磷元素的吸收，尤其是ZmUBC17基因具有组织表达特异性，在叶片中大量表达，推测ZmUBC17基因通过调控玉米对磷元素吸收和转运间接影响光合作用效率。

关键词： 玉米；泛素结合酶（E2）；生物信息学；系统发育进化树；基因表达

中图分类号： S513.035.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1476-08

0 引言

【研究意义】泛素化修饰作为蛋白质翻译后的重要调控方式之一，广泛存在于真核细胞中。泛素结合酶（E2）是泛素化过程的重要组成部分，参与蛋白质的泛素化修饰过程，通过调节蛋白活性而影响其功能的表达，从而保证生物体生命活动有序进行（Pickart and Eddins，2004），所有E2蛋白均含有一个保守催化结构域，大约由150个氨基酸组成，被称为UBC结构域，是蛋白质进行选择性降解的重要途径（Adam et al.，2011）。玉米是我国重要的粮食作物，其产量影响我国人民生活和社会经济发展。玉米产量受诸多因素的影响，如低温、干旱、病虫害和土壤肥力等生物胁迫或非生物胁迫，而E2在作物的抗逆境胁迫中发挥重要作用。磷作为植物体内ATP、核酸和磷脂等物质的重要组成元素，对调节植物体内代谢过程及促进植物生长发育等方面均发挥重要作用（田跃辉等，2014）。因此，研究在低磷条件下E2基因在玉米不同组织中的表达特异性，对探究E2蛋白对玉米吸收磷元素的作用机制具有重要意义。【前人研究进展】近年来，E2基因家族功能已逐渐成为研究热点，在拟南芥（Lau and Deng，2009）、酵母（王金利等，2010）、水稻（Bae and Kim，2014）、玉米（Jue et al.，2015）和香蕉（Dong et al.，2016）等真核生物中均有发现，研究方向集中在植物生长发育、DNA损伤修复及逆境胁迫等方面。Broomfield等（2001）研究发现，拟南芥AtUBC1参与蛋白质N末端序列剪切及DNA复制后的损伤修复，从而减少错配率，保证细胞生命活动有序进行。Xu等（2009）对拟南芥进行缺铁处理，结果显示AtUBC13基因过表达可提高根部对铁元素的吸收率，增强植株对缺铁症状的耐受性，将AtUBC13基因沉默后，植株则表现出明显的缺铁症状。王安邦等（2013）研究发现，香蕉MaUCE2基因在干旱、低温条件诱导下，其基因表达量明显升高，表明MaUCE2基因可能参与香蕉的耐冷调控过程。Mario等（2013）将大豆GmUBC2基因转入拟南芥中进行过量表达，结果发现，转基因植株的抗干旱和抗盐胁迫能力明显增强。Gu等（2009）研究表明，拟南芥AtUBC1和AtUBC2基因参与调控花发育，通过上调抑制开花基因FLC表达，从而抑制植株开花，双突变体Atubc1Atubc2单株表现出明显的早开花和莲座叶减少现象，而单个基因突变体Atubc1和Atubc2表型与野生型并无明显差异，说明AtUBC1和AtUBC2基因在功能上存在互补性。Lau和Deng（2009）研究发现，COP10作为E2-like蛋白，通过与DNA损伤结合蛋白DET1和DDB1相互结合形成复合物COP10-DET1-DDB1，参与调控拟南芥叶片的感光性及光周期过程。蔡佳文等（2016）研究发现，在干旱、盐和高温胁迫下龙葵SorUBC3基因表达具有组织特异性，在叶中其表达量显著高于其他组织，但叶片中MDA、POD和SOD含量无显著差异，表明逆境胁迫下SorUBC3基因过表达可抑制植株活性氧的产生，并对其进行清除。此外，Asuka等（2015）研究发现，人体UBE2T突变后会引发范可尼贫血症，并导致基因组的不稳定，患癌症概率增加。【本研究切入点】目前，对E2基因功能的研究主要集中在植物抗逆性等方面，而对E2基因在植物吸收大量元素途径中的作用及组织表达特异性和应答模式尚未见研究报道。【拟解决的关键问题】利用生物信息学初步分析玉米E2基因家族的理化性质和生物學功能，同时通过对玉米幼苗进行低磷处理，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测泛素E2基因在不同时间点及不同组织中的表达特性，为后续深入研究E2蛋白生物学功能提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为玉米自交系B73，由中国热带农业科学院南亚热带作物研究所玉米育种中心提供。RNA提取试剂盒（Quick RNA Isolation Kit）购自北京华越洋生物有限公司；逆转录试剂和SYBR Premix Ex Taq IITM试剂盒购自TaKaRa公司。主要仪器设备：LightCycler?96实时荧光定量PCR仪[罗氏诊断产品（上海）有限公司]和PRX-250A智能型人工气候箱（上海争巧科学仪器有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 样品处理及采集 玉米自交系B73种子萌发后，将其置于光照培养箱中，利用1×Hoagland培养液继续培养，培养条件为（26±1）℃，12 h光照/12 h黑暗。幼苗长至4叶期时，剔除弱苗和死苗，选择健壮、长势一致的幼苗，将其分为处理组和对照组。处理组：将幼苗置于1/20低磷培养液（磷浓度为标准培养液的1/20，其他营养元素成分及含量均不变）中进行培养，分别在培养0（对照）、1、6和24 h时采集幼苗根和叶，每个时间点随机选取5株，立即放入液氮中速冻，-80 ℃保存备用。对照组：将幼苗置于标准培养液中，取样时间和部位与处理组一致。所有试验均设3个重复。

1. 2. 2 总RNA提取及cDNA合成 参照RNA提取试剂盒说明分别提取处理组和对照组不同部位和不同采样时间点的样品总RNA，并采用逆转录试剂盒合成cDNA。

1. 2. 3 系统发育进化树构建及亚家族分类 根据已发表的玉米、水稻和拟南芥E2基因家族相关信息，分别在Maize Genetics and Genomics Database数据库（https：//www.maizegdb.org/）、The Arabidopsis Information Resource资源信息网（https：//www.arabidopsis.org/）和水稻全基因组数据库（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）中搜索下载37個拟南芥E2蛋白（Kraft et al.，2005）、48个水稻E2蛋白（Bae and Kim，2014）和75个玉米E2蛋白序列（Jue et al.，2015）。为了分析不同作物E2蛋白序列间的同源性，利用Clus-talW对玉米、拟南芥和水稻中所有含有UBC结构域的E2蛋白序列进行比对，并基于比对结果，利用MEGA 6.0邻接法（Neighbor joining，NJ）构建水稻、玉米和拟南芥E2蛋白的系统发育进化树，使用P-距离模型，重复次数为1000，其他选项均为默认设置。参照Kraft等（2005）的分类方法对水稻、玉米和拟南芥E2蛋白进行亚家族分类。

1. 2. 4 玉米E2基因的序列分析 从Maize Genetics And Genomics Database数据库（https：//www.maizegdb.org/）中搜索玉米E2基因，获得其氨基酸数目、编码区序列（CDS）长度和外显子数量等信息。利用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）进行蛋白质结构预测，利用ExPASy Proteomics Server（http：//www.expasy.org/proteomics）进行蛋白质理化性质预测，利用Plant-mPLocServer（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）进行蛋白质亚细胞定位。

1. 2. 5 qRT-PCR检测 为了解玉米E2基因在植物组织中的表达模式，以系统发育进化树中的XVIII亚家族玉米E2基因为对象，根据其基因序列，利用Primer Premier 5.0设计qRT-PCR引物（表1），分别以对照组和处理组不同时间点的玉米根和叶的cDNA为模板进行qRT-PCR检测，以β-Actin基因为内参，其引物见表1。反应体系10.0 μL：SYBR Premix Ex Taq IITM混合液5.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O补足至10.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性30 s；94 ℃ 30 s，58 ℃ 20 s，72 ℃40 s，进行40个循环，每份待测样品设3个重复，利用2-ΔΔCt计算相对表达量。

1. 2. 6 数据分析 采用SPSS 19.0进行差异显著性分析，并利用Excel 2016进行数据处理及作图。

2 结果与分析

2. 1 玉米E2蛋白系统发育进化树分析结果

系统发育进化树如图1所示，拟南芥、水稻和玉米的E2基因可划分为18个亚家族，各亚家族间基因功能和进化关系较相近，但E2基因数量差异明显，以亚家族VI的成员最多，为25个，其中玉米E2基因数量为9个，分别为ZmUBC10、ZmUBC14、ZmUBC23、ZmUBC26、ZmUBC32、ZmUBC46、ZmUBC52、ZmU-BC61和ZmUBC62，占玉米E2基因总数的12%，拟南芥和水稻E2基因数量分别为8个，分别占各自E2基因总数的21.6%和16.7%；以亚家族X、XII和XV的成员数最少，均为3个，且各亚家族中均分别含拟南芥、水稻和玉米E2基因各1个（亚家族X：AtUBC22、OsUBC33和ZmUBC68；亚家族XII：AtUBC37、OsUBC-48和ZmUBC27；亚家族XV：AtUBC27、OsUBC44和ZmUBC64），表明这3个亚家族E2基因在进化过程中相对保守，在拟南芥、水稻和玉米中功能高度相似，属于直系同源基因。

2. 2 玉米E2基因家族成员理化性质预测结果

玉米E2基因家族成员的序列分析结果如表2所示。玉米E2基因的编码区序列（CDS）长度为402～2616 bp，编码133～871个氨基酸。玉米E2基因外显子数目数量存在明显差异，以4～6个居多，最少为1个（ZmUBC41、ZmUBC59、ZmUBC60、ZmUBC61和ZmUBC74），最多为12个。不稳定指数大小表示蛋白稳定性的强弱，不稳定指数>40时被认定为不稳定蛋白，不稳定指数≤40时被认定为稳定蛋白。玉米E2蛋白的不稳定指数≤40的蛋白数目仅为10个，占蛋白家族数目的13.2%，故86.8%的玉米E2蛋白为不稳定蛋白。经亚细胞定位预测发现，大部分玉米E2蛋白定位于细胞核，只有ZmUBC28、ZmUBC34和ZmUBC40定位于细胞质。

选取系统发育进化树（图1）中亚家族XVIII的玉米E2蛋白为研究对象，对其氨基酸序列进行比对，结果如图2所示，并预测分析其表达模式和生物学功能。ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和ZmUBC58在蛋白UBC结构域序列上高度重复，但与ZmUBC17存在明显差异，表明ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和ZmUBC58基因的表达模式和生物学功能上可能存在高度相似性，但与ZmUBC17基因存在明显差异。

2. 3 E2基因在玉米不同组织中的表达分析

玉米含75个E2蛋白，且均具有E2活性，可对生物体生命活动进行调控（Jue et al.，2015）。本研究选取亚家族XVIII的5个E2基因，分别是ZmUBC17、ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和ZmUBC58。玉米幼苗经低磷处理后，不同时间点这5个基因在根和叶中的表达情况如图3所示。在玉米叶和根中，ZmUBC17、ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和ZmUBC58基因在处理6和24 h时的表达量均较处理前（0 h）显著升高（P<0.05，下同）。低磷处理下，ZmUBC17基因在根中不同时间点的表达量变幅较小，但在叶中0～24 h时的表达量呈逐渐升高的变化趋势，且在24 h时的表达量达最高。综上所述，玉米E2基因ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和ZmUBC58在低磷胁迫下，其基因相对表达量在玉米根和叶中均发生明显变化，表明这些基因可能参与植物根和叶对磷素的吸收和运输，而ZmUBC17基因只在叶片中大量表达，推测ZmUBC17作为调控因子参与植物光合作用中磷素转运过程，调控作物对磷元素的吸收从而间接影响植物光合作用效率。

3 讨论

目前，越来越多物种全基因组序列已测序成功，进而实现了在全基因组水平上构建系统发育进化树，以此准确分析各物种间的发育和进化关系。在基因组中具有高保守性的基因或家族常被作为分子标准用于构建系统发育进化树，且使用的基因越多，发育和进化关系分析结果也越准确（Heymans and Singh，2003；Woodhams and Hendy，2004）。本研究采用邻接法（NJ）构建水稻、玉米和拟南芥E2蛋白的系统发育进化树，并对其进行亚家族分类，结果显示玉米E2基因家族可分为18个亚家族，各亚家族间E2基因数量差异明显，以亚家族VI的成员最多，以亚家族X、XII和XV的成员数最少，各亚家族内部成员间的基因功能和进化关系较相近。本研究还对玉米75个E2蛋白进行理化性质预测，结果显示，同一个亚家族中，聚合在同一分支的成员理化性质较相似，表明E2基因家族功能相对保守，在进化过程中其功能并未发生改变，被称为直系同源基因；但不同亚家族的成员间理化性质差异明显，其原因是该家族基因在进化过程中形成新生物学功能，进而产生旁系同源基因，以保证生物体更好地适应环境（Thornton and De，2000）。这与陈学昭等（2015）、赵秋芳等（2016）的研究结论一致。

磷元素作为植物生长发育过程中必需的大量元素之一，可维持生物体正常的光合作用、蛋白质合成及细胞分裂、分化等生命活动，也可作为信号分子调控磷酸盐相关基因的表达（Vance et al.，2003）。E2作为泛素—蛋白酶体中重要的组成部分，在细胞周期、信号传递和环境胁迫中发挥重要作用（许传俊和李玲，2007）。本研究通过对亚家族XVIII的ZmUBC17、ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和Zm-UBC58基因进行qRT-PCR检测，结果发现这5个基因在玉米幼苗期根和叶中均有表达，但在不同处理时间点及组织的表达量存在明显差异，推测E2基因在不同植物组织中的表达均具有特异性，与前人研究结果（覃碧等，2013；张莉等，2018）一致。此外，本研究还发现，ZmUBC17基因的表达模式与ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和ZmUBC58基因有所不同；低磷处理下，ZmUBC17基因在根中不同时间点的表达量变幅较小，但在叶片中0～24 h时的表达量呈逐渐升高的变化趋势，尤其是24 h时的表达量达最高，表明ZmUBC17基因的响应部位是叶片，推测ZmUBC17参与玉米对磷元素的吸收和转运过程，也有可能参与植物的光合作用过程。作物在缺磷条件下其光合作用效率会明显下降。郭延平等（2003）研究发现，低磷处理下柑橘叶片的光合作用参数Fv/Fm和电子传递效率大幅降低。李绍长（2003）研究发现，在低磷处理下，玉米葉片PSII关闭程度增大，电子传递和光能转化效率降低。由此推测，ZmUBC17基因是植物光合作用中磷素转运过程的调控因子，调控作物对磷元素的吸收从而间接影响植物光合作用效率，但具体调控过程和机理仍有待进一步验证。

4 结论

玉米泛素E2蛋白可能参与调控对磷元素的吸收，尤其是ZmUBC17基因具有组织表达特异性，在叶片中大量表达，推测ZmUBC17基因是通过调控玉米对磷元素吸收和转运间接影响光合作用效率。

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（責任编辑 陈 燕）