宫俐 韩中波

（吉林市结核病防治研究所 吉林 吉林 132011）

Xpert Mtb/RIF技术使用半定量巢氏荧光PCR，该技术针对结核杆菌利福平耐药基因rpoB基因区设定引物、探针，扩增荧光检测，其是否发生基因突变，检测标本中是否含有结核杆菌及是否对利福平耐药，整个实验过程需3小时左右。线性探针杂交技术（Hain）检测技术直接从临床收集的病人肺部涂片阳性痰标本中提取核酸DNA、用生物素标记的引物进行多重PCR扩增和反向杂交。通过检测rpoB基因突变（编码RNA聚合酶β-亚单位）确定对利福平的耐药性；通过检测katG基因（编码过氧化氢酶）和inhA基因的启动子区（编码NADH烯酰酸性磷酸酶还原酶）确定对异烟肼的耐药性。从而，对来自培养物或病人肺部涂片阳性痰标本的结核分枝杆菌复合群及其耐利福平和/或异烟肼耐药基因进行分子生物学检测。

1.资料和方法

1.1 标本来源

2015年10月至2018年6月期间吉林市结核病防治研究所及所辖各县区结防所收治的疑似结核病患者共1345份痰标本。

1.2 检测方法

对1345份痰标本进行荧光染色涂片镜检检测、结核分枝杆菌培养、结核杆菌比例法药敏，相关操作及结果判定。其操作均按《结核病诊断细菌学检验规程》进行。

临床确诊肺结核病442例，对442例患者痰标本进行Xpert Mtb/RIF检测和线性探针杂交技术（Hain）检测，其操作均按试剂说明书进行。

2.结果

2.1 1345例初诊肺结核可疑患者，经X线、CT、实验室检查，临床最终确诊肺结核病442例，确诊率为32.9%。

2.2 Xpert Mtb/RIF检测及线性探针杂交技术（Hain）检测结核杆菌应用价值的评价

对442例肺结核患者痰标本进行涂片镜检，改良罗氏培养阳性率分别为24.4%（108/442）、42.3%（187/442），对442例肺结核病人痰标本进行Xpert Mtb/RIF检测、线性探针杂交技术（Hain）检测阳性率分别为49.5%（219/442）、44.8%（198/442）。Xpert Mtb/RIF检测阳性率略高线性探针杂交技术（Hain）检测，两种分子生物学方法检测阳性率明显高于涂片镜检，改良罗氏培养法。

2.3 Xpert Mtb/RIF检测利福平耐药

Xpert Mtb/RIF检测结果报告时间只需2～3小时，远远低于培养（2个月）、培养药敏（3个月）的报告时间。Xpert Mtb/RIF检测利福平耐药与传统方法比较，敏感度为90.2%、特异性为97.0%。见表1。

表1 Xpert Mtb/RIF检测利福平耐药与传统方法比较

2.4 线性探针杂交技术（Hain）检测利福平、异烟肼耐药

检测结果报告时间需2～3天，远远低于培养（2个月）、培养药敏（3个月）的报告时间。线性探针杂交技术（Hain）检测利福平耐药与传统方法比较，敏感度为88.0%、特异性为95.4%。检测异烟肼耐药与传统方法比较，敏感度为73.7%、特异性为90.3%。见表2。

表2 线性探针杂交技术（Hain）检测利福平耐药与传统方法比较

3.讨论

近年来，Xpert Mtb/RIF检测系统逐渐在基层推广使用、线性探针杂交技术（Hain）在具有条件地市级实验室推广，本文对Xpert Mtb/RIF检测技术、线性探针杂交技术（Hain）在检测临床标本诊断结核病及利福平、异烟肼耐药检测中的应用价值进行评价。

Xpert Mtb/RIF核酸检测采用美国公司GeneXpert检测系统，是一种半巢式实时定量荧光PCR体外扩增技术，针对利福平耐药rpoB基因81bp核心区间（RRDR）设计相关引物、核酸探针，检测相关基因是否发生突变，进而诊断是否结核杆菌感染以及是否对利福平耐药。本研究Xpert Mtb/RIF检测阳性率为49.5%，高于涂片镜检、结核杆菌培养法的阳性检出率，且时间远远小于培养（6～8周）。Xpert Mtb/RIF检测利福平耐药与传统方法比较，敏感度为90.2%、特异性为97.0%。表明Xpert Mtb/RIF技术检测结核杆菌具较高有的临床应用价值，可以对肺结核的诊断及合理规范治疗起到重要作用。线性探针杂交技术（Hain），从培养物或直接从临床收集的病人痰标本中提取核酸DNA、用生物素标记的引物进行多重PCR扩增和反向杂交。杂交包括下列步骤：扩增产物的变性，单链杂交、生物素标记的扩增产物与膜上的探针杂结合、严格漂洗、与链霉亲和素/碱性磷酸酶（AP）标记物孵育、碱性磷酸酶介导的显色反应，判读模板，便于对所获带型简易、快速做出解释。实验只需3天时间，即可检测出结核杆菌及利福平和异烟肼是否耐药。线性探针杂交技术（Hain）检测结核分支杆菌阳性率为44.8%，线性探针杂交技术（Hain）检测利福平耐药与传统方法比较，敏感度为88.0%、特异性为95.4%。检测异烟肼耐药与传统方法比较，敏感度为73.7%、特异性为90.3%。

Xpert Mtb/RIF检测技术、线性探针杂交技术（Hain）均是世卫组织认可的结核病快速检测新方法，Xpert Mtb/RIF检测技术具有简单、快捷，只需3小时左右即可得到报告；生物安全要求低，具备生物安全柜就可操作，具有较高的阳性检出率，Xpert Mtb/RIF检测利福平耐药与传统比例法药敏进行比较，敏感性和特异性均较高，在基层结核病防治机构具有较高的应用价值。研究表明，线性探针杂交技术（Hain）可快速、准确鉴定结核分枝杆菌并对利福平、异烟肼耐药基因进行检测,适用于检测结核菌株和痰标本，可大幅缩短药物敏感试验时间,有利于指导临床用药治疗。但该技术对实验室有严格要求，需要在通过认证的PCR实验室进行试验，更适合在市级结核病PCR实验室进行推广。