朱庆贺，张鹏宇，崔红玉，王观悦，王 爽，陈 曦，刘力威，史同瑞*

(1. 黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006;2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室，哈尔滨 150000)

4型禽腺病毒(Fowl Avianadenovirus serotype 4，FAdV-4)属于Ⅰ群禽腺病毒，能够引起鸡心包积水综合征[1]。该病最早在巴基斯坦的安卡拉首先被报道，因此又称安卡拉病[2-3]。近几年来，我国多个省份相继出现爆发，给养鸡业造成了严重的经济损失[4-6]。由于发病时鸡出现明显的心包积液症状[7-8]，因此该病的临床诊断主要以剖检为主，实验室诊断主要以病毒分离、PCR检测为主，也有利用琼脂扩散进行检测的报道[9-10]。不过以上诊断方法都存在一定的缺点，例如，病毒分离难度大，PCR方法批量检测样品工作量大，而琼脂扩散试验灵敏度较差等。因此有必要建立一种高效省时且灵敏度高的检测方法，能更好的对该病进行血清学检测以及血清抗体监测。

腺病毒粒子中的六邻体(hexon)是主要的衣壳蛋白，全长约2811 bp，带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇及次要的种特异性抗原决定簇。研究表明，hexon中几个比较大的抗原表位区都位于前段和中段，这一区域恰好位于病毒的表面，暴露性好，后段虽然也有较好的抗原性，但暴露性较差[11]。因此在试验中截短表达了hexon蛋白的前、中段进行原核表达，并应用于ELISA方法的建立。

1 材料与方法

1.1 血清及临床样品 病鸡心脏、肝脏组织样品、血清样品均收集自黑龙江省齐齐哈尔市甘南县肉鸡养殖场。FAdV-4阳性鸡血清由哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室惠赠，禽流感5、7、9型(Avian Influenza Virus, AIV-5、AIV-7、AIV-9)阳性鸡血清、新城疫(Newcastle Disease Virus, NDV)阳性鸡血清、传染性支气管炎(Infection Bronchitis Virus, IBV)阳性鸡血清由黑龙江省兽医科学研究所病毒研究室惠赠。FAdV-4阴性血清为SPF雏鸡血清，SPF鸡胚购自哈尔滨维科生物技术开发公司。

1.2 主要实验试剂 pET-28a载体购自大连宝生物工程有限公司，Taq DNA聚合酶、限制性内切酶EcoR Ⅰ/XhoⅠ、T4连接酶、DNA Marker购自TaKaRa公司；HRP标记兔抗鸡IgG购自北京百奥莱博科技有限公司；增强型HRP-DAB底物显色试剂盒、可溶性TMB底物显色液购自天根生物科技有限公司；PVDF膜购自密理博中国有限公司。

1.3 hexon蛋白克隆、表达及纯化 利用已发表的Kr-yeoju株hexon序列(登录号：HQ709228.1)设计引物，并添加EcoRⅠ/XhoⅠ为酶切位点。引物序列为：F:5'-GGAATTCCCCACCCGAAATGTCA￣CGAC-3'；R:5'-CCGCTCGAGGGCGGTGTTGTTGGTGTAGAG-3'，扩增长度为1032 bp基因片段，连接pET-28a载体，命名为pET-28a-hexon，测序正确的质粒转化至EscherichiacoliBL21(DE3)。0.8 mmol/L IPTG 37 ℃条件下6 h诱导重组菌，同时设立未诱导阴性对照。离心收集菌体进行超声破碎，12% SDS-PAGE电泳分析表达蛋白并切胶纯化。

1.4 Western blot分析 纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳后半干转印至PVDF膜，以 1︰100稀释的FAdV-4鸡阳性血清以及FAdV-4鸡阴性血清为一抗，以 1︰5000稀释的兔抗鸡IgG-HRP为二抗，进行Western blot分析。

1.5 间接ELISA方法的建立

1.5.1 间接ELISA反应条件的优化 以37 ℃ 1 h、37 ℃ 2 h和4 ℃过夜三种不同条件包被纯化的FAdV-4重组hexon蛋白，确定最佳包被条件；利用方阵滴定法对FAdV-4重组hexon蛋白的工作浓度和FAdV-4鸡阳性血清的稀释浓度进行了确定。以不同浓度脱脂乳封闭，确定最佳的封闭液浓度以及封闭时间。确定血清和HRP标记二抗最佳工作时间，确定底物作用时间。判定标准为：阳性血清(Positive serum，P)与阴性血清(Negative serum，N)OD450nm的P/N值高且P值≈1为原则将所选条件确定为ELISA反应的最佳反应条件。

1.5.3 特异性实验 在相同条件下对其他鸡几种常见病毒，如AIV-5、AIV-7、AIV-9、NDV、IBV阳性血清进行检测，同时设FAdV-4阴、阳性血清对照。

1.5.4 临床血清样本的检测 于黑龙江省齐齐哈尔市甘南县肉鸡养殖场采集并保存的21份临床血清样本通过建立的ELISA方法进行检测。

1.5.5 符合率试验 21份临床血清样对应的组织样品提取基因组后进行PCR检测，检测结果与ELISA 检测结果比较分析。

2 结 果

2.1 hexon基因扩增结果 在出现心包积液症状的鸡肝脏组织中扩增hexon基因，经1%琼脂糖核酸电泳分析，结果显示，扩增基因大小约为1032 bp(图1)。扩增基因连接载体后测序，结果显示为FAdV-4基因。

M: DL2000 DNA Marker; 1: hexon截短基因M: DL2000 DNA Marker；1: hexon-truncated gene图1 hexon截短基因扩增结果Fig 1 PCR amplification of hexon gene

2.2 hexon蛋白的表达与纯化 IPTG 诱导后，表达产物经SDS-PAGE分析，表达蛋白约为46 ku(图2)。

2.3 重组hexon蛋白Western blot验证 纯化蛋白进行Western blot鉴定，结果显示纯化的hexon蛋白能够与FAdV-4阳性血清结合，而与阴性血清无反应(图3)。

2.4 间接ELISA的建立及反应条件的确定 按照常规ELISA方法建立检测抗FAdV-4血清抗体的间接ELISA，对各反应条件进行了筛选和优化，结果如表1所示。

M：Protein Marker；1：纯化蛋白；2：诱导表达重组hexon蛋白细菌；3：未诱导表达细菌对照M：Protein Marker; 1：The purification of recombinant hexon protein;2：Lysed hexon-containing bacterial inclusion bodies; 3:Non-induced crude bacterial lysate from bacteria containing hexon plasmid图2 SDS-PAGE分析Fig 2 SDS-PAGE analysis

M：Protein Marker；1：纯化hexon重组蛋白;2：阴性血清对照M：Protein Marker; 1: The purification of recombinant hexon protein; 2: Negative serum control图3 Western blot鉴定结果Fig 3 Western blot analysis

筛选条件Filter condition重组hexon蛋白hexon protein封闭液Blocking solution待检血清Sample兔抗鸡-HRPRabbit Anti-Chicken Antibody-HRP显色底物Chromogenic substrate最佳稀释浓度Optimized dilutions1 ug/mL5%脱脂乳1︰1001︰5000 /反应条件Reaction condition4℃/12 h37℃/1 h37℃/1 h1 h15 min

"/"显色底物为商品化购买不需要稀释，直接加入至ELISA板中即可

2.6 特异性试验 利用建立的间接ELISA方法对FAdV-4、NDV、AIV-5、 AIV-7、AIV-9、IBV阳性血清进行检测，同时设阴性对照(Negative Control，NC)，结果表明：重组hexon蛋白与FAdV-4阳性血清特异性结合，与NDV、AIV-5、 AIV-7、AIV-9、IBV阳性血清均没有交叉反应(图5)

2.7 符合率试验 采用建立的间接ELISA检测方法，检测临床中21份鸡血清样品，其中15份为FAdV-4抗体阳性，而PCR结果显示18份样品呈阳性，两种方法阳性符合率为83.33%。结果表明，建立的ELISA方法和PCR方法符合率较好，可用于临床鸡血清样品的抗体检测。

图4 阴性样品结果分布图Fig 4 Negative samples normal distribution diagram

图5 ELISA 特异性试验Fig 5 Specific Detection of ELISA

检测方法Detection method阳性样本数Positive阴性样本数Negative总样本数Total阳性样本符合率ConcordanceELISA15621PCR1832183.33

3 讨论与小结

多数学者以Ⅰ群禽腺病毒代表株CELO株hexon蛋白作为包被抗原[12]，由于不同血清型hexon蛋白推导的氨基酸同源性差异较大，同源性的差异很可能会影响重组蛋白的抗原性。鉴于此，建立了以FAdV-4的基因组为DNA模板扩增并表达的hexon蛋白为包被抗原的ELISA检测方法，对于FAdV-4的血清学鉴定可能更有针对性，更适于临床出现心包积液症状病鸡的血清学诊断，但两种蛋白包被抗原对于FAdV-4的检测灵敏性是否具有差异仍需进一步研究验证。

目前，FAdV-4的实验室诊断仍然以PCR为主，ELISA方法的建立为该病的诊断提供了血清学方法。除作为诊断手段，ELISA也可以作为监测抗体效价的有效方法，黑龙江省兽医科学研究所兽药研究室在进行鸡心包积水综合征卵黄抗体的制备过程中血清抗体监测就是由建立的ELISA方法完成，抗体含量检测准确，相比较琼脂扩散方法灵敏度高，效果更好。