张 杰，苗银萍，娄亚坤，曾小宇，赵林萍

（郑州中道生物技术有限公司，河南郑州450000）

0 引言

口蹄疫是一种高度接触性传染病，猪、牛、羊等偶蹄类动物最易感。口蹄疫病毒目前共有7个血清型，分别命名为O、A、C、南非 I（SAT 1）、南非 II（SAT 2）、南非 III（SAT 3）和亚洲 I（Asia l），不同的口蹄疫病毒血清型之间不产生交叉免疫保护。2005—2014年，我国一共向世界动物卫生组织（OIE）报道了115次口蹄疫疫情，其中Asia 1型疫情46次，O型疫情38次，A型疫情31次。2009年以后，我国主要流行O型和A型口蹄疫疫情，其中O型口蹄疫病毒变异性强，传播广泛，严重危害畜牧养殖业发展［1］。

口蹄疫病毒是一种多抗原表位、高度变异的病毒。病毒无囊膜结构，衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白组成。研究表明，O型口蹄疫病毒表面至少有5个中和抗原表位，其中3个表位集中在VP1蛋白，由G-H环的133-157和C端的200-213氨基酸残基组成的线性表位是口蹄疫病毒最重要的抗原位点，也是影响抗原变异的关键位点。VP1蛋白可诱导动物产生中和抗体，是口蹄疫的免疫预防、遗传演化的重要研究对象［2］。

本研究以O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗体为检测靶标，以VP1蛋白HRP酶标记VP1血清抗体为原料，建立一种敏感、特异、快速的血清学ELISA检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

酶标板采购自美国康宁公司；HRP标记的VP1特异性兔抗血清采购自洛阳佰奥通实验材料中心；ELISA常规试剂均采购自北京鼎国昌盛公司；血清样品采集自南阳中道生态养殖场；液相阻断ELSIA试剂盒采购自兰州兽医研究所；PCR试剂盒采购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；基因和引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 VP1抗原制备

从NCBI基因数据库中调取O型口蹄疫病毒 O／HKN／10／2004衣壳蛋白编码序列（GenBank：DQ164887.1），合成基因及引物序列，构建重组菌株pET-32a-VP1／BL21，进行蛋白诱导表达。

1.2.2 VP1抗原包被浓度确定

用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释VP1蛋白，浓度分别为400 ng／μL、200 ng／μL、100 ng／μL、50 ng／μL、25 ng／μL，12.5 ng／μL，横向包被酶标板。阴阳性对照血清进行倍比稀释1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800，纵向加入酶标板，组成方阵进行间接ELISA。每孔加终止液50 μL，测定OD450 nm值。选择阳性OD值接近1.0，阳性OD值／阴性OD（P／N）值最大时的抗原包被浓度为最佳工作浓度。

1.2.3 阴阳性对照血清制备

筛选O型口蹄疫病毒抗体阴性、核酸双阴性猪。处死阴性猪分离血清，用PBS将血清作10倍稀释，并用0.22μm滤膜过滤除菌，作为阴性对照血清。O型口蹄疫病毒灭活苗免疫猪的血清效价达到1∶2056以上时，分离血清，作为阳性对照血清。

1.2.4 直接竞争ELISA最适反应条件的确定

用抗原最适工作浓度进行间接ELISA，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释 HRP标记兔抗血清（1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶10000），以 100μL每孔的量加入酶标板。37℃孵育完成后显色，读取OD450 nm值。选择阳性OD值接近1.0，P／N值最大时的HRP标记兔抗稀释度作为最适工作浓度。

1.2.5 直接竞争ELISA阈值判定

取100份阳性血请，按1∶32稀释后进行直接竞争ELISA检测。规定以100份血清的平均OD450值加上3倍标准误差（SD）作为阳性判定阈值，计算抑制率。

抑制率计算公式：

1.2.6 对已知阳性血清样品的敏感性试验

使用O型口蹄疫病毒液相阻断ELISA试剂盒鉴定获得120份阳性样品，使用本方法对样品进行检测，验证本方法的阳性检出率。

1.2.7 对已知阴性血清样品的特异性试验

使用O型口蹄疫病毒液相阻断ELISA试剂盒鉴定获得120份阴性样品，使用本方法对样品进行检测，验证本方法的阴性检出率。

2试验结果

2.1 VP1抗原制备

诱导表达5 h后，提取蛋白并进行SDS-PAGE鉴定，蛋白大小约为32KD（见图1）。

图1 重组菌诱导表达产物的SDS-PAGE鉴定结果

2.2 包被抗原最适工作浓度

结果表明，抗原浓度为50 ng／μL时，阳性OD值接近1.0，P／N值最大，包被抗原的最适工作浓度为50 ng／μL。

2.3 酶标抗体最适浓度

结果表明，酶标记VP1兔抗血清稀释度为1∶2000时，阳性OD值接近1.0，P／N值最大。

确定HRP标记兔抗血清的最佳工作浓度为1∶2000稀释。

2.4 阈值判定标准

阈值判定标准为：若阳性对照平均OD值＜0.4，阴性对照平均OD值＞0.7，则实验判定为有效，继续计算抑制率。抑制率大于30%为阳性，抑制率小于30%为阴性。

2.5 敏感性试验

使用本方法检测120已知阳性临床血清，检出阳性样品109份，有11份未检出。结果表明本方法对120份阳性样品的敏感性为90.8%。

2.6 特异性试验

使用本方法检测120已知阴性临床血清，检出阴性样品112份，有8份未检出。结果表明本方法对120份阴性样品的特异性为93.3%。

3 讨论

我国目前采取免疫与扑杀相结合的口蹄疫防控策略，血清学抗体监测是影响疫情防控的关键所在。口蹄疫的血清学诊断广泛应用于进出口贸易监测、疑似病例确诊、疫病净化以及疫苗免疫效果监测［3］。其中OIE推荐的血清学诊断技术有3种，包括病毒中和试验（VN）、固相阻断 ELISA和液相阻断ELISA。VN试验是最经典的血清学诊断方法，但是该方法需要使用细胞进行病毒培养，试验周期长。与VN试验相比，液相阻断ELISA和固相阻断ELISA均缩短了试验时间，但是仍然需要多次的抗体孵育和洗涤，检测速度受限制。

本研究建立了一种直接竞争ELISA抗体检测方法，该方法以O型口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1作为包被抗原，可针对VP1特异性抗体进行检测。检测原理是辣根过氧化物酶（HRP）标记的VP1抗原特异性兔源抗体与待测血清样品中的口蹄疫病毒抗体竞争结合酶标板微孔中包被的O型口蹄疫病毒基因工程抗原，然后加入显色液，通过HRP催化显色反应，显色深浅与待测样品中的抗体含量呈反相关。本方法将血清孵育与酶标抗体孵育同时进行，检测时间缩短，具备敏感、特异、快速、制备简单等特点，可广泛应用于O型口蹄疫疫苗免疫效果监测及流行病学调查。