刘海涛, 汪承润, 刘 玲, 柳云云, 叶 蕴, 罗康康

(淮南师范学院生物工程学院, 安徽 淮南 232038)

碳纳米管(CNTs)是当前广泛生产和使用的3大纳米材料之一,已应用于众多领域[1]。由于CNTs持续的开发、生产和应用,致使其不可避免地释放到环境中,其在环境中的迁移、转化以及进入环境后的毒性效应和健康风险已越来越引起人们的关注[2]。植物作为生态系统的关键组成部分,对CNTs存在潜在的累积效应,被认为是CNTs进入生物循环的重要途径[3-4]。因此,研究CNTs对植物的生理生化毒性对于评价其生态安全性至关重要。

一般来说,按照所含石墨烯片的层数可将CNTs分为单壁碳纳米管(SWCNTs)和多壁碳纳米管(MWCNTs)。相对于SWCNTs,MWCNTs更易制取且用途更为广泛。因此人们更为关注MWCNTs的生态安全性。研究表明,MWCNTs对动物[2,5]、植物[3-4,6-7]、微生物[8-9]、人体[10-11]均会产生有害作用。CNTs的表面功能化可以改变材料本身的化学和物理学特性,使其可以更好地分散于介质中,并具有更佳亲水性、稳定性和生物相容性,从而增强材料本身的工业化应用潜力[12]。因此,作为CNTs表面功能化的典型代表,羧基化多壁碳纳米管(MWCNTs-COOH)比MWCNTs具有更广的市场应用前景,其进入环境后可能导致的潜在生态风险性更值得关注。

由于具有高比表面积,CNTs进入环境后往往会成为其他污染物的载体,并对其毒性产生影响[13-14]。重金属污染是一个世界范围内的生态、环境和健康问题,在多数污染区域能够同时检测到1种以上重金属,因此,自然环境中的植物往往暴露于多种重金属的复合污染中。已有研究证明,CNTs具备吸附重金属的能力,并能够增强重金属离子向植物细胞内部的渗透[14]。在CNTs与重金属复合污染的环境介质中,两者之间不可避免地会发生相互作用,进而干扰重金属的环境行为和对生态系统的毒性效应。然而,国内外有关CNTs复合多种重金属对植物(包括农作物)的生态风险性的研究仍鲜见报道。因此,研究拟采用蚕豆幼苗作为实验对象,选取Pb和Cd作为典型重金属,研究蚕豆幼苗暴露于MWCNTs-COOH、Pb+Cd,以及Pb+Cd+MWCNTs-COOH复合污染溶液后其叶片组织活性氧(ROS)、抗氧化酶活性及其同工酶图谱、蛋白羰基化产物(氧化损伤蛋白)、热休克蛋白70 (HSP70)、内肽酶(EP)同工酶活性以及非蛋白巯基(NPT)的变化,以期为早期诊断和科学评价MWCNTs与Pb、Cd复合污染的生态风险性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 MWCNTs-COOH

MWCNTs-COOH (纯度w>95%,羧基质量分数w为2.56%;内径范围3～5 nm;外径范围8～15 nm;长度0.5～50 μm;比表面积233 m·g-2;灰分w<1.5%;电导率>100 S·m-1)购自中国科学院成都有机化学研究所。使用前对其进行6次间歇式超声萃取处理〔30 s·(2 min)-1〕,并利用透射电子显微镜(TEM) (JEM-100CX, 日本)对样品进行表征。在透射电子显微镜下MWCNTs-COOH呈管状结构,直径为(8.97±1.25) nm (图1)。

图1 MWCNTs-COOH的透射电镜(TEM)图Fig.1 TEM image of MWCNTs-COOH

1.2 蚕豆幼苗的培养与处理

蚕豆种子(Viciafaba)为淮南当地常见品种(青皮豆)。种子用φ=0.1%次氯酸钠溶液浸没10 min后用Milli-Q水充分漂洗,室温浸泡24 h后转移至22 ℃培养箱内催芽。种子萌发后筛选根尖长2 cm左右的幼苗,悬浮培养于Hoagland营养液中[15]。设置如下处理组:对照组(CK, 0.5×Hoagland营养液)、2.5 mg·L-1MWCNTs-COOH(以下简写为2.5)、5.0 mg·L-1MWCNTs-COOH(以下简写为5.0)、10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH(以下简写为10.0)、20.0 μmol·L-1Pb+5.0 μmol·L-1Cd (以下简写为Pb+Cd)、Pb+Cd+2.5 mg·L-1MWCNTs-COOH (以下简写为Pb+Cd+2.5)、Pb+Cd+5.0 mg·L-1MWCNTs-COOH (以下简写为Pb+Cd+5.0)、Pb+Cd+10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH (以下简写为Pb+Cd+10.0)。制备MWCNTs-COOH和Pb+Cd母液,应用0.5×Hoagland营养液分别稀释母液,制备上述各组处理溶液,pH值控制在5.5～5.8之间,Zeta电位控制在(-10.92±1.09) mV(ZetaPALS仪测定)。每剂量组准备3个水槽(长×宽×高:40 cm×30 cm×15 cm),每个水槽悬浮培养6株幼苗。幼苗在营养液中预培养2 d后开始置于不同处理溶液中,培养条件为:白天15 h,22 ℃,光照强度240 μmol·m-2·s-1;夜晚9 h,20 ℃,相对湿度80%。每3 d更换1次各组处理溶液,幼苗处理15 d后(6～8片真叶)取适量等位叶片开展实验。

1.3 叶片组织超氧自由基和过氧化氢产物的测定

超氧自由基(O2·-)的测定参考汪承润等[16]的方法。称取1 g 植物叶片,液氮速冻并立即研磨成粉状,并在提取液(250 mmol·L-1磷酸缓冲液,pH值8.0,含10 μmol·L-1磷酸吡哆醛,1 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA),5 mmol·L-1二硫苏糖醇(DTT)中匀浆,离心(离心半径9.5 cm, 4 ℃,10 000 r·min-1)25 min,上清液用于O2·-测定。分别取1 mmol·L-1NH4Cl和50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH值7.8)各0.5 mL,加入0.5 mL上清液,25 ℃水浴60 min,再分别加入17 mmol·L-1对氨基苯磺酸和7 mmol·L-1α-萘胺各1 mL,25 ℃水浴20 min后测定530 nm处吸光度值(OD530 nm),重复3次。以亚硝酸钠作为底物,按上述方法制备标准曲线,根据标准曲线换算出NO2-浓度,再计算出O2·-含量。

过氧化氢(H2O2)含量测定参考李玲等[17]的方法。称取1 g新鲜叶片,加入5 mL预冷的丙酮,冰浴条件下速磨、匀浆,离心(离心半径9.5 cm, 4 ℃,12 000 r·min-1)20 min。吸取1 mL上清液,分别加入0.2 mL浓氨水、0.1 mLφ=10%的四氯化钛-盐酸溶液混匀。反应5 min后,离心(离心半径9.5 cm，4 ℃,12 000 r·min-1)15 min,弃上清液。用预冷的丙酮洗涤沉淀2次,再向沉淀中加入3 mL 2 mol·L-1硫酸溶液,待沉淀完全溶解后测定OD412 nm,重复3次。以100 μmol·L-1H2O2-丙酮试剂作为反应底物,按上述方法制备标准曲线,根据标准曲线计算H2O2含量。

1.4 叶片组织4种抗氧化酶酶活性的测定及同工酶图谱分析

参照WANG等[18-19]的方法制备粗酶液, 所有操作过程均在0～4 ℃条件下进行。参照BRADFORD[20]的方法测定粗酶液蛋白含量。

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)以及过氧化物酶(POD)酶活性参照GARCA-LIMONES等[21]的方法测定。SOD酶活性测定:3 mL反应混合液含1.75 mL 50 mmol·L-1磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液, pH值7.8)、0.3 mL 0.1 mmol·L-1乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、0.3 mL 130 mmol·L-1甲硫氨酸、0.3 mL 750 μmol·L-1NBT、0.3 mL 20 μmol·L-1核黄素和30 μL酶液,以酶液抑制氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光还原50%的抑制率为1个酶活力单位;CAT酶活性以1 min分解1 μmol H2O2为1个酶活力单位;APX酶活性以1 min氧化1 μmol抗坏血酸为1个酶活力单位;POD酶活性以1 min氧化1 μmol愈创木酚为1个酶活力单位。重复3次。

SOD、APX、POD和CAT同工酶的电泳和显色均参考GARCA-LIMONES等[21]的方法进行。应用Bio-Rad Mini-PROTEAN电泳系统和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离酶蛋白,以25 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷(Tris)、192 mmol·L-1甘氨酸(pH值8.3)作为电泳缓冲液,在4 ℃条件下进行电泳。SOD和APX同工酶电泳的分离胶为100 g·L-1,POD同工酶电泳的分离胶为80 g·L-1,CAT分离胶为60 g·L-1,积层胶均为50 g·L-1。每个剂量组做3块胶。

1.5 蛋白羰基化产物和HSP70的免疫印迹分析

蛋白羰基化产物的免疫印迹参照ROMERO-PUERTAS等[22]的方法并略加改进。50 μL粗酶液与50 μLφ=10% 十二烷基硫酸钠(SDS)、100 μL 20 mmol·L-12,4-二硝基苯肼(DNPH)/φ=20%三氟乙酸(TFA)混合,空白组用100 μLφ=20%TFA 代替20 mmol·L-1DNPH/φ=20% TFA。室温下静置30 min,依次加入100 μL 2 mol·L-1Tris (pH值8.0)/φ=30%甘油/φ=6%β-巯基乙醇和50 μLφ=1%溴酚蓝,混匀后上样,进行SDS-PAGE电泳(10%分离胶,5%积层胶)。半干转印(Bio-Rad, USA)后依次包被一抗(小鼠抗DNPH 单克隆IgE抗体, Sigma-Aldrich, 1∶2 000)和二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgE抗体, Sigma-Aldrich, 1∶40 000)。最后用Supersignal West Femoto Trial Kit发光试剂盒(Thermo, USA)进行显色,X光片曝光显影,Canon数码相机拍照。

HSP70的SDS-PAGE电泳和蛋白质免疫印迹(Western blotting) 方法参照WANG等[18]的方法进行。粗酶提取液与裂解缓冲液(0.5 mol·L-1Tris, pH值6.8,φ=20% 甘油、φ=3% SDS、φ=0.01%溴酚兰和φ=10%β-巯基乙醇混合后,立即煮沸4 min,冰上冷却。每孔上样23.2 μg可溶解性蛋白,同时上样标准蛋白分子Marker(PageRulerTMprestained protein ladder, #SM0671, Fermentas)。电泳结束后,通过半干转印系统(Semi-Dry Transfer System,Bio-Rad)将胶块上的蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF 膜, Amersham Pharmacia)。PVDF膜用φ=5%脱脂奶粉(用pH值为7.5的TBST缓冲液,即50 mmol·L-1Tris、150 mmol·L-1NaCl、φ=0.05% Tween-20配制),室温下封闭2 h。TBST 缓冲液漂洗后,用小鼠抗-HSP70/HSC70单克隆抗体(1∶5 000)(SPA-820, Stressgen, Victoria, 加拿大)于4 ℃条件下包被8 h。TBST 缓冲液漂洗后,PVDF 膜转移至二抗(1∶25 000)(山羊抗抗鼠IgG HRP, Stressgen, Victoria, 加拿大),于室温下包被1.5 h。最后用ECL发光试剂盒(SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate)进行发光,X光片显影,Canon数码相机拍照。

1.6 EP同工酶分析

EP同工酶实验参照DISTEFANO等[23]的方法进行,略加改进。SDS-PAGE凝胶电泳分离内肽酶同工酶, 80 g·L-1分离胶(内含φ=0.1%明胶),50 g·L-1积层胶,4 ℃条件下电泳。电泳结束后,胶块浸没于0.1 mol·L-1冰醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.5),37 ℃恒温水浴后转移至250 mmol·L-1Tris-HCl(pH值7.5)中,36 ℃恒温孵育2 h,再将凝胶转移至显色液(φ=0.1%考马斯亮蓝R-250/φ=40%甲醇/φ=10%冰乙酸)中,室温下染色2 h,最后用φ=40%甲醇/φ=10%冰乙酸脱色。EP同工酶为蓝色背景下的白色带型。Canon数码相机拍照。

1.7 NPT产物的测定

NPT产物的测定参照RAMA等[24]提出的方法。称取0.2 g叶片样品,加5 mLφ=5%磺基水杨酸,冰浴研磨,离心(离心半径9.5 cm，4 ℃,12 000 r·min-1)15 min, 取上清液并定容至5 mL。反应体系为1 mL上清液、1.85 mL 0.2 mol·L-1Tris-HCl (pH值8.2)、0.15 mL 10 mmol·L-15,5-二硫基-2,2-二硝基苯甲酸(DTNB),反应20 min后用多功能酶标仪(TECAN Infinite M200)于412 nm处测定吸光度值,以不加DTNB为空白,以还原性谷胱甘肽为标样,制作标准曲线。

1.8 数据分析

采用SPSS 16.0统计分析软件进行数据处理与分析,单因素方差分析(one-way ANOVA)进行数据间的差异显著性检验,若差异显著(P<0.05),采用Duncan法进行多重比较。采用Origin 7.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 O2·-和H2O2含量变化

如图2所示，与对照组相比,MWCNTs-COOH单一处理组(以下简称单一组) O2·-含量呈增加趋势,其中,5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH单一组诱导了O2-显著积累(P<0.05);H2O2含量呈先降低后增加的趋势,其中5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH单一组诱导了H2O2显著积累(P<0.05)。

CK为对照； 2.5、5.0、10.0分别表示2.5、5.0、10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH； Pb+Cd表示20.0 μmol·L-1Pb+5.0 μmol·L-1Cd。同一幅图中直方柱上方小写字母不同表示处理间某指标差异显著(P<0.05)。

与Pb+Cd处理组相比,MWCNTs-COOH复合Pb+Cd处理组(以下简称复合组) O2·-含量呈先降低后增加的趋势,但各处理组无显著差异;H2O2含量随着MWCNTs-COOH的浓度增加而显著积累(P<0.05)。

MWCNTs-COOH复合组与MWCNTs-COOH单一组相比,O2·-含量在MWCNTs-COOH质量浓度为2.5 mg·L-1时,复合组高于单一组;在MWCNTs-COOH质量浓度为5.0～10.0 mg·L-1时,复合组低于单一组。H2O2含量在MWCNTs-COOH质量浓度为2.5和10.0 mg·L-1时,复合组高于单一组;在MWCNTs-COOH质量浓度为5.0 mg·L-1时,复合组低于单一组。

2.2 4种抗氧化酶活性及同工酶图谱的变化

如图3所示，与对照组相比,MWCNTs-COOH单一组SOD酶活性呈升高趋势,5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH单一组诱导了SOD酶活性显著升高(P<0.05)。CAT和APX酶活性呈先升高后降低的趋势,当MWCNTs-COOH质量浓度为5.0 mg·L-1时,CAT和APX酶活性最强,其中各单一组CAT酶活性显著升高(P<0.05),5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH单一组APX酶活性被显著诱导(P<0.05)。POD酶活性呈先升高后降低的趋势,当MWCNTs-COOH质量浓度为2.5 mg·L-1时,POD酶活性最强,其中2.5 mg·L-1MWCNTs-COOH单一组POD酶活性被显著诱导(P<0.05)。

与Pb+Cd处理组相比,MWCNTs-COOH复合组SOD和POD酶活性呈先降低后升高的趋势,其中各复合组SOD酶活性未见显著性升高(P>0.05),5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH复合组诱导了POD酶活性显著升高(P<0.05)。CAT酶活性呈先升高后降低的趋势,其中,各复合组CAT酶活性未见显著性升高。APX酶活性呈升高趋势,其中5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH复合组诱导了APX酶活性显著升高(P<0.05)。

CK为对照； 2.5、5.0、10.0分别表示2.5、5.0、10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH； Pb+Cd表示20.0 μmol·L-1Pb+5.0 μmol·L-1Cd。同一幅图中直方柱上方小写字母不同表示处理间某指标差异显著(P<0.05)。SOD酶活性以酶液抑制NBT光还原50%的抑制率为1个酶活力单位; CAT酶活性以1 min分解1 μmol H2O2为1个酶活力单位; APX酶活性以1 min氧化1 μmol抗坏血酸为1个酶活力单位; POD酶活性以1 min氧化1 μmol愈创木酚为1个酶活力单位。

MWCNTs-COOH复合组与MWCNTs-COOH单一组相比,SOD酶活性在MWCNTs-COOH质量浓度为2.5 mg·L-1时,复合组高于单一组;在MWCNTs-COOH质量浓度为5.0～10.0 mg·L-1时,复合组低于单一组。在各浓度MWCNTs-COOH条件下,CAT酶活性均表现为复合组低于单一组,当MWCNTs-COOH质量浓度为10.0 mg·L-1时,两者差异显著(P<0.05)。在各浓度MWCNTs-COOH条件下,APX酶活性均表现为复合组均高于单一组。在MWCNTs-COOH质量浓度为2.5 mg·L-1时, POD酶活性表现为复合组显著低于单一组(P<0.05);在MWCNTs-COOH质量浓度为5.0～10.0 mg·L-1时,复合组显著高于单一组(P<0.05)。

由图4可以看出,各处理组4种抗氧化酶同工酶图谱和带型光密度(代表酶活性)变化不尽相同。SOD同工酶图谱均显现4行带。CAT同工酶图谱只出现1行带。APX同工酶图谱在复合组中均诱导了3行带的出现,而其他处理组只有2行带。POD同工酶图谱在5.0～10.0 mg·L-1单一组诱导了带型数量的减少和带型光密度的变化(与对照组相比);在2.5 mg·L-1复合组诱导了带型数量和带型光密度明显减少,而5.0～10.0 mg·L-1复合组诱导了带型光密度显著增加(与Pb+Cd处理组相比)。比较各处理组的酶活性(图3)与其同工酶带型光密度(图4),发现两者变化趋势基本一致。

CK为对照组; a为2.5 mg·L-1 MWCNTs-COOH; b为5.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH; c为10.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH; d为20 μmol·L-1Pb+5μmol·L-1Cd; e为20 μmol·L-1Pb+5 μmol·L-1Cd+2.5 mg·L-1 MWCNTs-COOH; f为20 μmol·L-1Pb+5 μmol·L-1Cd+5 mg·L-1 MWCNTs-COOH; g为20 μmol·L-1Pb+5 μmol·L-1Cd+10 mg·L-1 MWCNTs-COOH。

2.3 蛋白羰基化产物、HSP70和EP同工酶图谱的变化

如图5所示，与对照组相比,MWCNTs-COOH单一组蛋白羰基化产物的带型光密度呈先降低再升高的趋势。与Pb+Cd处理组相比,MWCNTs-COOH复合组蛋白羰基化产物的带型光密度亦呈先降低再升高的趋势。同一浓度MWCNTs-COOH条件下,MWCNTs-COOH复合组蛋白羰基化产物的带型光密度始终高于MWCNTs-COOH单一组。

与对照组相比,MWCNTs-COOH单一组HSP70含量呈升高趋势。与Pb+Cd处理组相比,MWCNTs-COOH复合组HSP70含量呈降低趋势。MWCNTs-COOH复合组与MWCNTs-COOH单一组相比,在MWCNTs-COOH质量浓度为2.5～5.0 mg·L-1时,HSP70含量表现为复合组明显高于单一组;但MWCNTs-COOH质量浓度为10.0 mg·L-1时, HSP70含量表现为复合组远低于单一组。

EP同工酶图谱可见3行白色带,且带型数量未见增减,但其光密度发生明显改变。各处理组EP同工酶带型光密度均高于对照组,且总体呈上升趋势,表明其酶活性被诱导而升高。

2.4 NPT产物含量的变化

如图6所示，与对照组相比,MWCNTs-COOH单一组NPT含量呈先升高后降低再升高的趋势,MWCNTs-COOH单一组NPT含量始终高于对照组。10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH单一组诱导了NPT含量显著升高(P<0.05)。与Pb+Cd单一组相比,MWCNTs-COOH复合组NPT含量呈先略微降低再升高趋势,其中5.0～10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH复合组NPT含量被显著诱导(P<0.05)。与MWCNTs-COOH单一组相比,MWCNTs-COOH复合组NPT含量在各浓度MWCNTs-COOH条件下均高于单一组,且MWCNTs-COOH质量浓度为5.0～10.0 mg·L-1时两者差异显著(P<0.05)。

CK为对照组; a为2.5 mg·L-1 MWCNTs-COOH; b为5.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH; c为10.0 mg·L-1 MWCNTs-COOH; d为20 μmol·L-1Pb+5μmol·L-1Cd; e为20 μmol·L-1Pb+5 μmol·L-1Cd+2.5 mg·L-1 MWCNTs-COOH; f为20 μmol·L-1Pb+5 μmol·L-1Cd+5 mg·L-1 MWCNTs-COOH; g为20 μmol·L-1Pb+5 μmol·L-1Cd+10 mg·L-1 MWCNTs-COOH。

CK为对照； 2.5、5.0、10.0分别表示2.5、5.0、10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH； Pb+Cd表示20.0 μmol·L-1Pb+5.0 μmol·L-1Cd。直方柱上方小写字母不同表示处理间某指标差异显著(P<0.05)。

3 讨论

3.1 MWCNTs-COOH、Pb+Cd及其复合暴露对O2·-和H2O2产物的影响

植物通过各种途径产生O2·-和H2O2,它们性质活泼,有很强的氧化能力,对许多生物功能分子都有破坏作用,称为活性氧(ROS)。有研究表明,ROS的迅速积累及所导致的氧化损伤被认为是MWCNTs积聚而导致植物毒性的根本原因[4,6-7]。该研究中,无论是MWCNTs-COOH单一处理还是MWCNTs-COOH与Pb+Cd复合暴露,MWCNTs-COOH均显著诱导了蚕豆幼苗叶片中O2·-和H2O2的大量产生和积累,且MWCNTs-COOH浓度越高,O2·-和H2O2的累积量越大,ROS的大量产生和积累必然会加剧叶片组织的氧化损伤和毒性效应。而且,过量的O2·-和H2O2可以通过Haber-Weiss或Fenton途径转变为毒性更强的OH,导致细胞组分遭受更大的毒性效应。伴随着上述活性氧自由基的积累,细胞中蛋白质羰基化水平呈上升趋势。

3.2 MWCNTs-COOH、Pb+Cd及其复合暴露对4种抗氧化酶活性及同工酶图谱的影响

ROS也是信号分子,可以诱导植物体的氧化应激反应[25]。为了控制ROS的产生和积累,植物体通常通过上调一系列抗氧化酶同工酶的合成来缓解ROS积累可能导致的氧化损伤。如SOD酶可以将O2·-转化为H2O2和O2;CAT和POD酶可以将H2O2转化为H2O和O2;APX酶是抗坏血酸-谷胱甘肽循环的重要组分,参与清除H2O2[16]。该研究中,MWCNTs-COOH单一、Pb+Cd及其复合暴露均诱导了上述4种抗氧化酶同工酶及其活性不同程度升高。这在一定程度上减少了ROS的积累,缓解了MWCNTs-COOH及Pb+Cd对蚕豆幼苗的氧化胁迫。部分抗氧化酶活性在高浓度MWCNTs-COOH条件下降低,这可能是由于过量的ROS累积超出了防御酶系统的清除能力,并抑制了酶活性,反映出各种抗氧化酶活性对ROS的清除能力及敏感性或耐受力的不同。值得注意的是,无论是MWCNTs-COOH单一处理,还是MWCNTs-COOH与Pb+Cd复合暴露,当MWCNTs-COOH质量浓度为2.5 mg·L-1时,与对照组相比,只有CAT酶活性被显著诱导(P<0.05)。因此,CAT可作为诊断MWCNTs-COOH或MWCNTs-COOH复合重金属环境污染的敏感的生物标志物。这与10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH 与Pb+Cd的复合导致CAT酶活性是唯一降低至对照组以下的处理这一结论也是一致的,即CAT酶活性的敏感性再次被证明。此外,MWCNTs-COOH复合组中SOD和CAT酶活性低于MWCNTs-COOH单一组,APX和POD酶活性高于MWCNTs-COOH单一组,这应与Pb+Cd的作用有关。

3.3 MWCNTs-COOH、Pb+Cd及其复合暴露对蛋白羰基化产物、HSP70和EP同工酶图谱的影响

当ROS自由基的积累超出抗氧化酶的清除能力时,自由基通过直接氧化修饰蛋白质分子的氨基酸侧链,或者与脂质过氧化,或糖基化的醛基产物发生次级作用,进而诱导多肽链中羰基化基团的产生和积累[22,26]。因此,可以利用羰基化衍生物含量的高低来判定植物组织细胞氧化损伤的程度。该研究中,无论是MWCNTs-COOH单一处理,还是MWCNTs-COOH与Pb+Cd复合暴露,当MWCNTs-COOH质量浓度增加至10.0 mg·L-1时,蛋白质分子的羰基化水平显著升高,表明此时叶片组织正遭受严重的氧化损伤,这与O2·-和H2O2在此时累积量最大的结果也是相符的。当MWCNTs-COOH质量浓度为5.0和10.0 mg·L-1,MWCNTs-COOH复合组蛋白羰基化产物的带型光密度要高于Pb+Cd处理组,当MWCNTs-COOH质量浓度为10.0 mg·L-1时尤为明显,说明MWCNTs-COOH的添加加剧了叶片的氧化损伤。

有研究报道,异常蛋白的积累可诱导HSP基因的表达[27]。HSP70的生理功能涉及到变性蛋白质分子的修复或降解、细胞自稳态的维持及生物体对各种胁迫因子的适应,通常被作为监测植物环境胁迫的生物标志物[28]。该研究中,羰基化蛋白的含量变化与叶片组织中HSP70产物的合成关系密切。MWCNTs-COOH单一组与对照相比,HSP70的合成呈增加趋势,且显著升高,表明由于MWCNTs-COOH加入及浓度的不断升高,导致了蚕豆幼苗叶片细胞氧化胁迫损伤的加剧,进一步诱导了HSP70的合成并参与到氧化损伤蛋白的修复过程当中;随着HSP70含量的增加,在一定MWCNTs-COOH浓度范围内羰基化蛋白呈现降低,但当MWCNTs-COOH质量浓度为10.0 mg·L-1时,虽然HSP含量最多,但羰基化蛋白反而增加,这说明自由基诱导的氧化损伤蛋白的积累超出了HSP70的清除能力。MWCNTs-COOH复合组与Pb+Cd处理组相比,HSP70的含量呈下降趋势,表明MWCNTs-COOH加入抑制了HSP70的合成;当MWCNTs-COOH质量浓度为2.5和5.0 mg·L-1时,复合组HSP70及羰基化蛋白的含量明显要高于对照组和MWCNTs-COOH单一组,表明其细胞氧化损伤程度与MWCNTs-COOH单一组相比更甚;同时,当MWCNTs-COOH质量浓度为10.0 mg·L-1时,虽然羰基化蛋白的含量最高,但HSP70的含量却出现极为明显的降低,表明此时氧化胁迫已经远远超出了HSP70蛋白的修复能力,HSP70蛋白本身可能已经失活或损伤。可以看出,MWCNTs-COOH复合组的毒性效应明显更强。

实际上,复合污染按污染物之间的相互关系可分为非交互作用(剂量加加、效应加加作用)和交互作用(协同、拮抗作用)[29]。该研究中,MWCNTs-COOH复合Pb+Cd污染是属于非交互作用还是交互作用中的协同作用，尚需结合其他实验数据综合判断。如后续研究可以对MWCNTs-COOH复合组蚕豆幼苗叶片组织中的重金属含量进行定量测定,如与Pb+Cd处理组大体相当,则可判断是非交互作用,反之,则可断定是协同作用。同时,HSP70蛋白的诱导表达和响应水平较敏感,可作为指示MWCNTs-COOH或MWCNTs-COOH复合重金属环境污染诱导蚕豆幼苗叶片组织早期氧化胁迫的生物标志物。另外,ROS也被证明与HSP70的表达有关[30-31]。结合该研究,笔者认为,高浓度的MWCNTs-COOH通过ROS途径诱导了蚕豆幼苗叶片组织内氧化修饰蛋白的产生和积累,进而诱导了HSP70表达水平的升高。

细胞内被氧化修饰的蛋白质分子通常可被胞内蛋白降解酶(如EP等)选择性降解,在植物组织中也存在这种现象[32]。EP有多个同工酶,用于降解衰老或氧化胁迫诱导的损伤蛋白[23,26]。该研究中,无论是MWCNTs-COOH单一处理,还是MWCNTs-COOH与Pb+Cd复合暴露,均诱导了EP同工酶活性的升高,MWCNTs-COOH浓度越高,酶活性升高越明显,且MWCNTs-COOH与Pb+Cd复合后,EP酶活性提升尤为明显,表明暴露于高浓度的MWCNTs-COOH的蚕豆幼苗叶片组织内大量的氧化损伤蛋白正被EP促进降解。因此,羰基化蛋白的产生和积累可能是诱导EP同工酶活性升高的因子之一,EP同工酶活性的诱导是蚕豆幼苗解毒的机制之一。值得注意的是,不论是MWCNTs-COOH单一处理,还是MWCNTs-COOH与Pb+Cd复合暴露,在MWCNTs-COOH质量浓度为10.0 mg·L-1时,虽然EP同工酶的活性升高,但蛋白羰基化产物的含量反而增加,这表明蚕豆叶片组织的氧化损伤已非常严重,EP同工酶活性虽趋于升高,但可能已超出其降解清除能力。

3.4 MWCNTs-COOH、Pb+Cd及其复合暴露对NPT产物的影响

巯基化合物在植物对重金属耐受和解毒中起到重要作用,而其中关系最紧密的当属谷胱甘肽(GSH)、植物络合素(PC)和半胱氨酸(Cys)在内的NPT物质[24,33]。植物利用NPT中的重要组分,即GSH合成PC,与重金属鳌和形成无毒的络合物转运到胞外或储存在液泡等细胞器内,以降低重金属离子的毒性[34]。该研究中,所有处理组叶片组织中NPT产物与对照相比均呈增加趋势,且10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH单一组、5.0和10.0 mg·L-1MWCNTs-COOH复合组与对照相比差异显著,表明MWCNTs-COOH和Pb+Cd胁迫下蚕豆幼苗可通过合成大量NPT产物以缓解外源污染物的氧化损伤或毒害程度。同时,NPT产物中的GSH还是植物体内重要的抗氧化剂和信号物质[35],GSH可以直接降低细胞内H2O2含量[36]。因此,MWCNTs-COOH单一组中,各处理组的NPT均高于对照组,但溶液中并无重金属,这应是由于MWCNTs-COOH诱导了H2O2的大量产生和积累,从而进一步诱导GSH的合成所致。MWCNTs-COOH复合Pb+Cd后,各处理组的NPT产物含量与Pb+Cd处理组相当或显著高于Pb+Cd处理组,这可能是由于外源MWCNTs-COOH加剧了植物叶片中Pb+Cd的富集,而重金属元素的富集进一步诱导了NPT合成及含量的显著增加。

4 结论

(1) MWCNTs-COOH单一或MWCNTs-COOH复合Pb+Cd诱导了蚕豆幼苗叶片组织中O2·-和H2O2的大量产生和积累,且MWCNTs-COOH浓度越高,O2·-和H2O2的累积量越大。ROS的大量产生和积累加剧了蚕豆幼苗叶片组织的氧化损伤和毒性效应,导致氧化损伤蛋白(蛋白羰基化产物)的显著增加。

(2) ROS作为信号分子诱导了SOD、CAT、APX及POD等同工酶及其酶活性的升高,增强了蚕豆幼苗叶片清除ROS的能力,一定程度上减缓了自由基的积累。HSP70的诱导表达和EP同工酶活性的升高表明细胞内损伤蛋白的修复或促进降解活性的增加。同时,NPT产物的合成亦被显著诱导,以降低重金属离子的毒性和细胞内H2O2的含量。

(3) 与Pb+Cd单一处理相比,MWCNTs-COOH与 Pb+Cd复合后抑制了HSP70的合成,促进了蛋白羰基化和NPT产物的累积,并显著提升了EP酶活性,加剧了叶片的氧化损伤和蛋白降解。