王希梅， 郭 玫， 王志旺， 张 程小丽

(甘肃中医药大学， 兰州 730000)

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种以关节软骨退行性变化与继发性骨质增生为基本特征的慢性关节疾病，随着社会老龄化的加剧，OA已成为常见病、多发病[1]。近年来研究显示[2,3]，局部使用植物多糖对OA有明显的疗效，如谭杨等[3]研究发现人参多糖对骨关节炎有明显的治疗作用。另一方面，研究发现红芪多糖对肝纤维化动物的骨丢失有一定的影响[4]，尚未发现红芪多糖在骨关节炎方面的研究。红芪所含红芪总多糖是红芪的主要有效成分，采用溶剂法从红芪中分离、纯化得红芪总多糖(hedysari polysaccharides，HPS)，采用Sephadex色谱法从HPS中分离得到红芪多糖HG-1(hedysari polysaccharide HG-1，HHG-1)，进一步研究发现HHG-1是由葡萄糖组成的均多糖；预实验提示红芪总多糖对OA有一定的疗效。本实验在上述研究的基础上复制OA模型，观测关节活动性、关节滑膜的病理变化及糖胺多糖的含量、血液流变学及抗组织氧化酶的活性，探讨HPS及HHG-1对大鼠OA的治疗作用及机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

中药红芪采自甘肃省陇西县首阳镇，经甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根； HPS采用水提醇沉法制备，经苯酚-硫酸法在490 nm处测定总多糖含量84.66%； HHG-1采用葡聚糖凝胶G-200分离获得，纯度为98.30%。透明质酸钠(sodium hyaluronate，SHA)，山东博士伦福瑞达制药有限公司，国药准字H20067379，批号160916014。木瓜蛋白酶(papain)，Sigma公司产品，批号：BCBR9920V。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)为南京建成生物工程研究所产品；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

BS1103型电子分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司产品；TGL-16G冷冻高速离心机，上海安亭科学仪器厂产品；722型分光光度仪，上海第三分析仪器厂产品；CH-212型光学显微镜，日本Olympus产品；BI-2000型医学图像分析系统，成都泰盟科技有限公司产品。

1.3 动物

Wistar大鼠，雌雄各半，180～220 g，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，实验动物质量合格证号SCXK(甘)2010-0001。甘肃中医药大学实验动物中心饲养，实验动物设施使用许可证号SYXK(甘)2011-0001。

1.4 分组、造模及给药

将56只Wistar大鼠适应性饲养7 d后，按性别、体重随机分为7组(n=8)：即空白对照组(Control)、模型对照组(Model)、阳性对照组(SHA)、红芪总多糖高剂量组(HPS-H，)、红芪总多糖低剂量组(HPS-L)、红芪多糖HG-1高剂量组(HHG-1-H)、红芪多糖HG-1低剂量组(HHG-1-L)。根据文献[5]结合预实验，大鼠每个膝关节腔注射4%的木瓜蛋白酶50 μl。每隔3 d注射1次，连续注射3次，空白对照组同法注射等体积生理盐水。造模第10天开始每个膝关节腔注射药液0.1 ml(HPS 1.05、0.35 mg/joint、HHG-1 0.45、0.15 mg/joint、SHA 1.00 mg/joint)，每隔3 d注射1次，空白对照组注射生理盐水0.1 ml，连续5周。

1.5 指标测定

末次给药24 h后用戊巴比妥钠麻醉大鼠，在恒定拉力下测定膝关节最大屈伸角度(活动度)。股静脉取血，抗凝，测定血液粘度，剩余血液凝固，分离血清，按试剂盒说明书测定血清SOD活性、GSH-Px、MDA含量。处死大鼠，切取完整的左侧膝关节，立即打开关节腔，刮取关节面上的滑膜组织，测定滑膜厚度，之后置于冰浴中的组织匀浆器内，加入冰生理盐水，制成2%滑膜组织匀浆，在4℃下4 000 r/min离心10 min，取上清液测定糖胺多糖(glycosaminoglycan, GAG)含量(二甲基亚甲蓝分光光度法)。切取右侧股骨内髁关节，经甲醛固定、脱钙、石蜡包埋、切片后HE染色，在200倍光镜下观察关节病理学变化，参考Mankin’s评分标准[6]对软骨组织结构进行半定量分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 HPS及HHG-1对膝关节活动范围及关节滑膜厚度的影响

与空白对照组比较，OA模型组膝关节伸展角度明显变小，关节面滑膜明显增厚(P<0.01)；经HPS及HHG-1干预后，与模型对照组比较，膝关节伸展角度明显变大，关节面滑膜厚度明显减小(P<0.05,P<0.01，表1)。

2.2 HPS及HHG-1对关节滑膜中糖胺多糖含量的影响

OA模型组关节滑膜组织中糖胺多糖的含量显著下降，与空白对照组比较有统计学意义(P<0.01)；HPS组及HHG-1组关节滑膜组织中糖胺多糖的含量明显升高，与模型对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01，表2)。

2.3 HPS及HHG-1对关节组织病理学的影响

光学显微镜下，空白对照组大鼠膝关节表面平整光滑，软骨分层及潮线清晰可见(图1A)；OA模型组关节表面凹凸不平，多毛刺，局部偶有塌陷，软骨分层及潮线模糊不清(图1B)。HPS组及HHG-1组大鼠关节病理变化出现不同程度的缓解(图1D, 图1E, 图1F, 图1G)。对大鼠膝关节的病理变化进行Mankin’s评分，结果显示，局部注射木瓜蛋白酶后大鼠关节出现明显病理变化，Mankin’s评分显著升高，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；经HPS和HHG-1干预后，Mankin’s评分明显下降，与模型对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01，表2)。

GroupStretching angle (°)Synovial thickness (μm)Control155.0±5.5234.5±36.4Model143.1±6.0**362.1±52.8**SHA153.1±6.8##262.4±42.0##HPS-H151.6±6.5#275.6±44.6#HPS-L150.6±6.3#306.5±51.1#HHG-1-H152.5±6.6##270.4±43.6##HHG-1-L150.9±5.8#296.4±47.0#

SHA: Sodium hyaluronate; HPS-H: High-dose group of hedysari polysaccharides; HPS-L: Low-dose group of hedysari polysaccharides; HHG-1-H: High-dose group of hedysari polysaccharide HG-1; HHG-1-L: Low-dose group of hedysari polysaccharide HG-1

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Fig.1Effects of HPS and HHG-1 on joint histopathology in OA rats (HE ×200)

A: Control group; B: Model group; C: Sodium hyaluronate group; D: High-dose group of hedysari polysaccharides; E: Low-dose group of hedysari polysaccharides; F: High-dose group of hedysari polysaccharide HG-1; G: Low-dose group of hedysari polysaccharide HG-1

GroupGAG (ng/mg)Mankin’s scoreControl624.1±64.40.25±0.46Model425.6±38.3**4.25±1.49**SHA536.9±56.6##2.50±1.20#HPS-H501.6±46.6##2.25±1.04##HPS-L469.0±41.8#△2.63±1.19#HHG-1-H516.0±48.6##2.38±1.06## HHG-1-L474.9±44.9#△3.13±1.46

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vsSHA group

2.4 HPS及HHG-1对血液粘度的影响

采用木瓜蛋白酶复制OA模型后，与空白对照组比较，大鼠全血低切、中切及高切血粘度显著升高(P<0.01)。经HPS及HHG-1干预后，与模型对照组比较，全血粘度不同程度下降(P<0.05,P<0.01，表3)。

GroupLow shear(1/10)Medium shear(1/60)High shear(1/150)Control11.21±2.426.54±1.775.11±1.50Model20.80±4.72**12.70±2.65**9.68±2.29**SHA14.37±2.99##8.55±2.61##6.85±2.03#HPS-H14.14±2.91##8.36±2.51##6.83±1.90#HPS-L15.98±3.64#9.98±2.41#7.36±2.20HHG-1-H14.10±2.86##8.30±2.49##6.79±1.80#HHG-1-L15.68±3.13#9.92±2.64#7.08±1.99#

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.5 HPS及HHG-1对血清抗氧化系统的影响

与空白对照组比较，OA模型组血清SOD、GSH-Px活性显著下降，MDA含量显著升高，(P<0.01)。在HPS及HHG-1的干预下，与模型对照组比较，SOD、GSH-Px的活性明显升高，MDA的含量下降(P<0.05,P<0.01，表4)。

GroupSOD (U/ml)GSH-Px(U/ml)MDA(nmol/ml)Control108.09±10.36307.11±58.407.25±1.39Model87.10±8.83**219.67±46.02**16.91±3.62**SHA105.98±10.46##286.33±53.56#9.34±2.59##HPS-H103.09±10.03##288.22±54.11#9.48±2.61##HPS-L96.11±9.87245.33±48.8912.16±2.96#HHG-1-H106.52±10.94##290.67±56.08#8.98±2.24##HHG-1-L98.12±9.72#276.33±50.23#11.59±2.71##

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3 讨论

OA好发于膝关节、脊柱及手指关节等部位，是以关节软骨退变和骨质增生为基本特征的慢性进行性骨关节疾病。随着全球老龄化的加剧，OA的发病率迅速增加，部分地区60岁以上人群OA的发病率甚至高达50%，严重影响人民的生活质量并加重人民的经济负担[1]。OA的病因和发病机制尚不明确，临床上药物对OA治疗的目的是缓解关节疼痛、改善关节功能，目前尚无有效的根治措施。关节腔内注射透明质酸是目前治疗OA广泛使用的方法之一[7]。透明质酸是一种酸性黏多糖，近年来有人[8,9]将植物多糖注入关节腔，发现对OA亦有明显的疗效。红芪为甘肃道地药材，HPS为红芪的主要有效成分，含量达4%以上，采用葡聚糖凝胶从红芪总多糖中分离出HHG-1，HHG-1是由葡萄糖构成的均一多糖。本研究显示，HPS及HHG-1局部给药后能扩大OA膝关节的伸展角度，改善关节局部病理学变化。另一方面，关节软骨基质中蛋白多糖合成减少或降解增多导致软骨的抗压缓冲功能降低，局部压力过大而刺激骨质增生，因此，软骨退变与骨质增生为OA的基本病理特征。软骨中蛋白多糖的合成不足是软骨退变的主要表现之一，而糖胺多糖(GAGs)是蛋白多糖的最主要成分(占蛋白多糖分子量的80%～90%)[10]。本研究显示，HPS及HHG-1能提高软骨中GAGs的含量，缓解OA关节软骨退变，抑制关节面骨质异常增生，改善关节功能；高剂量的HPS及HHG-1对OA关节面骨质增生、软骨中GAGs的影响与透明质酸钠相当。

在OA众多发病机制中，改善血液流变学、提高软骨代谢水平、缓解自由基损伤日益受到人们的重视。血液粘度升高可致血流缓慢甚至瘀血，引起骨组织缺血缺氧，代谢水平下降，软骨组织中蛋白多糖等合成水平下降，从而引起软骨生理功能下降；另一方面，骨组织缺血缺氧可促进自由基生成，自由基氧化、破坏骨组织，骨小梁受损兼之激活破骨细胞，刺激骨质改建，最终引起骨质增生[11]。本实验结果显示HPS及HHG-1可降低全血粘度，改善血液流变学，缓解骨组织代谢障碍，提高抗氧化酶的活性，缓解自由基对软骨的损伤，改善OA关节功能。

综上所述，HPS及HHG-1对OA有一定的治疗作用，高剂量的HPS和HG-1比低剂量有更好的疗效趋势，但没有统计学差异，同时HPS与HG-1的疗效明显差异；改善血液流变学而改善关节软骨代谢水平、提高抗氧化酶活性而保护软骨及滑膜组织是其作用机制之一。