李 洁， 谈文博， 王 艳

(西北师范大学体育学院, 甘肃 兰州 730070)

研究发现，衰老与肌肉质量和肌肉功能的下降有关[1]。身体活动在抵抗与衰老相关的生理衰退中起重要作用，保持足够水平的身体活动可使寿命增加和降低代谢疾病以及其他慢性疾病的风险[2]。定期有氧运动可以通过在线粒体水平的有益效果来增加健康的生命预期并延长寿命[3]。长时间有氧运动训练可以降低老年大鼠心肌线粒体DNA含量，增加线粒体呼吸链酶复合体I、Ⅳ活性，延缓衰老过程中线粒体功能的退行性变化[4]。本实验旨在通过观察有氧运动对衰老大鼠骨骼肌线粒体脂质过氧化水平、抗氧化能力、三羧酸循环及呼吸链功能的影响，探讨有氧运动延缓衰老的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雌性健康Wistar大鼠，2月龄10只，12月龄20只，由甘肃省中医药大学动物实验中心提供，动物生产许可证为SCXK(甘)2011-001，常规饲养。将12月龄的雌性Wistar大鼠随机分为老年安静组(aged control group,AC,n=10)及老年运动组(aged exercise group,AE,n=10)；2月龄的雌性Wistar大鼠为青年安静组(young control group,YC,n=10)。

1.2 训练方案

所有大鼠在DSPT-202型跑台(中国杭州钱江科工贸公司)上进行每天1次、为期1周的适应性运动(坡度为0°，速度8.2 m/min、运动时间5 min)。正式实验时，运动组大鼠进行坡度为5°，速度为15.2 m/min，运动时间第1天为15 min、第2天为30 min、从第3天开始为45 min，每周6 d，共12周[5]。安静组大鼠进行常规饲养。

1.3 取材及线粒体制备

12周运动训练结束后，按0.3 ml/100 g体重腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠。将大鼠断头处死，于冰盘上迅速取出腓肠肌，置于液氮中冷冻，-20 ℃低温保存待用。按文献[6]方法匀浆并提取腓肠肌线粒体，线粒体提取在Universal 320R台式高速冷冻离心机(德国)上进行。

1.4 测试的指标及方法

1.4.1 线粒体抗氧化酶活性及脂质过氧化物含量的测定 按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书，在UVmimi-1240岛津紫外可见光分光光度计(日本岛津精密科学仪器有限公司)上测定锰-超氧化物歧化酶(Mn2+-superoxide dismutase, Mn2+-SOD)、谷光甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性及丙二醛(melondialdehyde, MDA)含量。

1.4.2 线粒体三羧酸循环限速酶及呼吸链酶复合体活性的测定 应用双抗体夹心法，严格按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书，在LA Labsystems Multiskan MS酶标仪(芬兰)上测定柠檬酸合酶(citrate synthase, CS)、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase, ICD)、α-酮戊二酸脱氢酶复合体(α-ketoglutarate dehydrogenase complex, α-KGDHC)活性及呼吸链复合体Ⅰ～Ⅳ(respiratory chain complexⅠ～Ⅳ, RCCⅠ～Ⅳ)活性。

1.4.3 蛋白质浓度测定 以牛血清白蛋白为标准，考马斯亮蓝G-250法测定。牛血清白蛋白及考马斯亮蓝为Sigma公司产品。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠骨骼肌线粒体中蛋白质含量

提取的各组大鼠骨骼肌线粒体的蛋白质含量分别为(μg/ml)：YC组599.42，AC 组581.91，AE组 609.78。

2.2 各组大鼠骨骼肌线粒体自由基代谢相关指标的比较

与YC组相比，AC组SOD活性显著升高(P<0.05)，升高26.00%，GSH-Px活性下降3.89%，但无显著性差异，MDA含量显著上升(P<0.05)，上升24.26%；AE组SOD和GSH-Px活性均显著升高，分别升高54.94%(P<0.01)和28.61%(P<0.05)，MDA含量显著上升(P<0.05)，上升12.43%。与AC组相比，AE组SOD及GSH-Px活性均显著升高(P<0.05)，分别升高22.97%和33.81%，MDA含量显著下降(P<0.05)，下降9.52%(表1)。

CroupSOD(U/mg prot)GSH-Px(U/mg prot)MDA(nmol/mg prot)YC5.46±1.4515.17±3.891.69±0.34AC6.88±1.43*14.58±3.502.10±0.45*AE8.46±1.66**#19.51±4.51**1.90±0.36**

YC: Young control group; AC: Aged control group; AE: Aged exercise group

*P<0.05,**P<0.01vsYC group;#P<0.05vsAC group

2.3 各组大鼠骨骼肌线粒体三羧酸循环限速酶活性的比较

与YC组相比，AC组CS和α-KGDHC活性均显著下降(P<0.05)，分别下降4.22%和3.83%，ICD活性下降1.03%，但无显著性差异。AE组CS、ICD和α-KGDHC活性均显著上升(P<0.01)，分别上升9.37%、14.05%和15.02%。与AC组相比，AE组 CS、ICD和α-KGDHC活性均显著上升(P<0.01)，分别上升14.18%、15.24%和19.61% (表2)。

GroupCSICDα-KGDHCYC650.96±48.63182.32±22.3188.68±12.24AC623.49±46.54*180.44±20.1585.28±10.95*AE711.93±54.89**##207.94±26.73**##102.00±16.87**##

CS: Citrate synthase; ICD: Isocitrate dehydrogenase; α-KGDHC: α-Ketoglutarate dehydrogenase complex

*P<0.05,**P<0.01vsYC group；##P<0.01vsAC group

2.4 各组大鼠骨骼肌线粒体呼吸链酶复合体活性的比较

与YC组相比，AC组RCCⅠ、RCCⅡ和RCCⅣ活性均显著下降(P<0.05)，分别下降5.44%、8.51%和6.99%，RCCⅢ活性显著升高(P<0.05)，升高5.22%；AE组 RCCⅠ～Ⅳ活性均显著升高(P<0.01)，分别升高12.46%、14.41%、14.10%和14.14%。与AC组相比，AE组 RCCⅠ～Ⅳ活性均显著升高(P<0.01)，分别升高18.93%、25.05%、8.44%和22.72%(表3)。

3 讨论

3.1 有氧运动对衰老大鼠骨骼肌线粒体脂质过氧化及抗氧化能力的影响

研究发现，许多与年龄相关的疾病中都存在大分子氧化损伤的累积现象[7]，线粒体氧化应激在衰老和健康状况中具有中心作用[8]，在老化的骨骼肌线粒体中活性氧簇(ROS)增加[9-10]。本研究结果显示，老年大鼠骨骼肌线粒体中脂质过氧化水平显著升高，这可能与随着年龄的增长，线粒体电子传递链组分含量下降、内膜亲水性增加及蛋白质损伤等因素，使电子不能按顺序转移，电子漏增多，导致在线粒体内膜生成O2-·增加有关。此外，脂类对过氧化敏感性的增高可能也是衰老时线粒体脂质过氧化水平升高的原因。本研究结果还显示，老年大鼠骨骼肌线粒体抗氧化酶活性变化不一，SOD活性显著升高，GSH-Px活性无显著性变化，脂质过氧化水平升高。这可能是由于随着年龄的增长，为抵御ROS的增加，机体应激性的增加抗氧化酶的活性，但由于抗氧化酶活性变化不一及增加的幅度无法完全抵消ROS的增加，最终导致脂质过氧化水平升高。其机制还有待进一步研究。

有研究报道，采用维持衰老骨骼肌线粒体结构的方法后，线粒体ROS很少增加[11]，在活动活跃的老人中未观察到骨骼肌线粒体ROS增加[12]。本研究观察到，与不运动同龄大鼠比较，12周有氧运动可使老年大鼠骨骼肌线粒体抗氧化酶活性显著增高，脂质过氧化水平显著降低，说明老年个体仍保持着线粒体抗氧化功能的适应能力，这可能与运动促使ROS产生增多有关[13]。本研究结果显示，老年运动大鼠骨骼肌线粒体抗氧化酶活性与脂质过氧化水平均显著高于青年安静大鼠，这可能是由于年轻大鼠骨骼肌抗氧化酶活性与ROS相匹配，使氧化和抗氧化处于平衡状态。而衰老使骨骼肌ROS增多，骨骼肌应激性增加抗氧化酶活性，复合长期的有氧运动可进一步提高衰老骨骼肌线粒体抗氧化酶的功能，在一定程度上降低了脂质过氧化程度，但抗氧化酶活性的提高幅度无法完全抵消由于衰老和运动增加的ROS量，氧化和抗氧化处于不平衡状态，最终使脂质过氧化水平升高。还有研究表明[14]，6周负重训练可有效缓解D-半乳糖大鼠骨骼肌的衰老进程，其机制可能与减轻骨骼肌氧化应激及脂质过氧化有关。

3.2 有氧运动对衰老大鼠骨骼肌线粒体三羧酸循环限速酶活性的影响

研究发现，衰老大鼠骨骼肌有氧代谢酶活性明显下降，10周跑台运动训练后有氧代谢酶活性显著增加[15]。本研究显示，老年大鼠骨骼肌线粒体三羧酸循环限速酶活性均低于年轻大鼠，经12周跑台运动后限速酶活性均提高，且显著高于不运动的同龄大鼠和年轻大鼠。说明老化本身不是导致线粒体功能障碍的主要原因，老化可能与久坐的生活方式和较低的能量需求有关[16]。此外，老年骨骼肌线粒体仍可对运动产生适应，增强机体的有氧工作能力。其机制可能为：运动提高了老年机体骨骼肌线粒体抗氧化酶活性, 降低脂质过氧化损伤，维护和增强线粒体的结构和功能。另一方面，运动使线粒体三羧酸循环功能增强，促进呼吸链电子传递，减少电子漏和自由基生成，从而形成良性循环。

Tab. 3 Comparison of activities of respiratory chain complex I ～ Ⅳ in rat skeletal muscle mitochondria among the three groups (IU/L, n=10)

RCC: Respiratory chain complex

*P<0.05,**P<0.01vsYC group；##P<0.01vsAC group

3.3 有氧运动对衰老大鼠骨骼肌线粒体呼吸链功能的影响

研究表明，线粒体呼吸控制率及线粒体编码的酶活性随年龄增长而下降[17]。本研究观察到，随着年龄的增长，大鼠骨骼肌线粒体RCCⅠ、RCCⅡ、RCCⅣ活性均显著下降，可能与随着年龄增长，骨骼肌线粒体自由基损伤增加、mtDNA受损，线粒体编码的酶合成受到影响及呼吸链酶损伤有关。本研究还显示，随着年龄增长，大鼠骨骼肌线粒体RCCⅢ活性显著提高，这是否是由于RCCⅠ、RCCⅡ活性下降，导致的RCCⅢ活性代偿性增加？还需进一步研究。

本研究还观察到，12周有氧运动可显著提高老年大鼠骨骼肌线粒体呼吸链酶活性，且显著高于年轻安静大鼠，表明老年骨骼肌线粒体呼吸链功能仍可对有氧运动产生适应性提高，从而增强机体的有氧工作能力。已有研究表明，骨骼肌线粒体具有高度适应性，可以根据组织的代谢需求增加或减少其含量，受到刺激后线粒体生物发生程序可有效活化，即使年龄较大，有氧运动仍可减少骨骼肌线粒体内容物的损失、改进线粒体功能[16]，这可能与有氧运动增加与线粒体生物发生、融合和裂变有关的蛋白质的含量有关[18]。另外，线粒体呼吸链功能的提高，尤其是RCCⅣ活性提高，可使呼吸链电子漏减少，阻止自由基的产生，可有效地保护线粒体结构和功能。

另有研究认为，随着年龄的增长而发生的线粒体衰变是不能被抵消的，除非增强身体活动[19]。运动刺激可提高老年个体的线粒体适应及功能，不仅能改善肌肉功能和生活质量[20]，而且可提高健康水平、延长寿命[19]。

综上所述，有氧运动可提高老年大鼠骨骼肌线粒体的抗氧化能力，降低脂质过氧化水平，提高三羧酸循环及呼吸链功能，促进线粒体能量代谢，延缓衰老过程中线粒体功能的退行性变化。