刘满光,路文雅,李国松

(1.河北省林业科学研究院,河北 石家庄050061;2.河北省林木良种工程技术中心,河北 石家庄050061;3.河北省林木种苗管理站,河北 石家庄050091)

油松 (Pinus tabulaeformis)四季常青,树形美观,是中国北方极具价值的造林和绿化树种,但常常受到松树枯梢病的危害。松树枯梢病又称烂皮病、溃疡病,是植物侵染性病害,主要危害油松、赤松 (Pinus densiflora Sieb.et Zucc.)和黑松 (Pinus thunbergii Parl.)等,其主要症状为油松顶芽枯死、枯枝、枯梢以及枯萎,此外,还表现出树干流脂、溃疡、坏死以及木材蓝变和根茎腐烂等症状[2],常伴有黄点枯针病和赤枯病[1]发生。目前,防治松树枯梢病的主要方法为化学防治,其是林间常用的防控方法[3-4]。但化学防治的高毒药剂不仅会造成环境的污染,对天敌和人畜都不安全,所以寻找防治松树枯梢病的高效低毒药剂具有重要意义。

近年来,人们发现了一些低毒甚至无毒的无机化合物,这些化合物在防治病害及抑菌方面都表现出很好的优势及前景。据报道,亚磷酸钾盐具有明显的杀菌效果,其中亚磷酸氢二钾和亚磷酸二氢钾是多种杀菌剂及肥料的活性成分,对玉蜀黍赤霉(Ascomycetes)、瓜果腐霉 (Pythium aphanidermatum)、灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、禾谷丝核菌 (Rhizoctonia zeae)及核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorum)有明显的抑制效果[5];此外,研究表明硼酸也有抑菌作用,例如硼酸对由灰霉菌 (Botrytis cinerea)导致的葡萄灰霉病有明显的抑菌效果[6],并且能够抑制由链核盘菌 (Monilinia laxa)导致的桃褐腐病[7]和由胶胞炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides)导致的芒果炭疽病[8]等。但亚磷酸、硼酸、亚磷酸二氢钾以及亚磷酸氢二钾对油松枯梢病菌 (Sphaeropsis sapinea)的影响还未见报道。

因此,本研究采用菌丝生长速率法和凹玻片法测定亚磷酸、硼酸、亚磷酸二氢钾以及亚磷酸氢二钾4种药剂对油松枯梢病菌丝生长及孢子萌发的抑菌活性,研究4种药剂对油松枯梢病菌丝生长及孢子萌发的抑菌效果,旨在为松树枯梢病的防治提供新思路,同时为亚磷酸、硼酸、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾这4种药剂的抑菌潜力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及设备

1.1.1 供试菌株

油松枯梢病的病菌分离自油松枯梢病的病枝,由河北农业大学林木病理实验室提供,编号为KU571453;发病油松松针采自秦皇岛联峰山公园。

1.1.2 供试药剂

硼酸 (H3BO3)由天津市恒兴化学试剂制造有限公司生产,纯度≥99.5%。亚磷酸 (H3PO3)由山东西亚化学工业有限公司生产,纯度为99%。亚磷酸二氢钾 (H2KO3P)由天津希恩思生化科技有限公司生产,纯度为98%。亚磷酸氢二钾 (K2HPO3)由天津希恩思生化科技有限公司生产,纯度为98%。

1.1.3 仪器设备

使用的仪器设备包括超净工作台、高压灭菌锅、培养皿、人工气候箱、电子天平、移液枪等。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的制备

PDA培养基制备方法 马铃薯(Solanum tuberosum)(去皮)200g洗净切成小块,加入1 000mL蒸馏水煮30min,双层纱布过滤,加蒸馏水定容至1 000mL,然后加入葡萄糖20g,琼脂15-20g,加热待琼脂完全融开后,倒入锥形瓶中,用封口膜封口,高压灭菌备用。

1.2.2 药剂溶液配制

在超净工作台上进行,分别称取4种待测药剂放入灭菌小烧杯中,用无菌水溶解稀释,根据预试验结果,将其配成相应浓度梯度的母液备用。

1.2.3 孢子悬浮液的制备

将采来的发病油松松针用无菌水冲洗干净后,0.1%的升汞表面消毒30s,无菌水冲洗3次后,放置在无菌培养皿中,用接种针将其成熟的分生孢子器挑下来,轻轻按压,并加入适量无菌水浸泡,使分生孢子完全释放于无菌水中,配成浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液,保存于-4℃冰箱中备用。

1.2.4 供试药剂对菌丝生长的影响

在超净工作台中无菌操作环境下,采用菌丝生长速率法[9],将10mL母液倒入温度为50-60℃灭菌溶融状态的90mL的PDA培养基中,充分摇匀,倒入直径9cm的培养皿内,冷却凝固后,将在PDA培养基上培养了3d的松树枯梢病菌用直径5mm的打孔器在距菌落中心3cm处打取菌饼,然后接种于含药PDA培养基中央,并置于25℃恒温培养箱内黑暗培养,3d、5d、7d后,以十字交叉法测量菌落直径取平均值。每处理重复3次,以加10mL无菌水的培养基为对照。通过以下公式计算药剂对菌丝生长的抑制率:I=(D0-D1)/D0×100%,式中,I为抑制率,D0为空白对照菌落增长直径,D1为药剂处理菌落增长直径。

1.2.5 供试药剂对孢子萌发的影响

根据预试验结果,用无菌水配制成不同浓度梯度的供试药液,采用凹玻片法[10],将孢子悬浮液及配好的供试药液各20μL,滴于盖玻片上混匀,翻转平放于凹玻片凹槽上,放在铺有湿润滤纸的培养皿中,用保鲜膜封上进行保湿,并置于25℃培养箱中恒温光照培养,每个处理3次重复,以无菌水为对照。每隔8h镜检1次,每个载玻片观察5个视野,记录孢子萌发数量,计算萌发率及萌发抑制率。以萌发出的芽管长度大于孢子直径长度(指直径最小的一边)的一半时计为萌发。孢子萌发率 (%)=萌发的孢子数/孢子总数×100;孢子萌发抑制率 (%)=对照孢子萌发量-处理孢子萌发量/对照孢子萌发量×100。

1.3 数理统计

采用Excel软件整理录入数据,用DPS、SPSS软件对数据进行分析,并计算各药剂的毒力回归方程和EC50值 (半最大效应浓度)。

2 结果与分析

2.1 4种药剂对油松枯梢病菌丝生长的影响

由表1可以看出,亚磷酸、硼酸、亚磷酸二氢钾和亚磷酸氢二钾4种药剂对油松枯梢病菌丝的生长均有一定的抑制作用,抑制率均随各药剂浓度的增加而增大,且随时间的延长而下降。即各药剂浓度对油松枯梢病菌丝生长的抑制率在第3d最高。第3d,浓度为0.5g/L的亚磷酸对油松枯梢病的抑制率为97.16%,浓度为10g/L的硼酸对油松枯梢病的抑制率为79.2%,浓度为28g/L的亚磷酸二氢钾及亚磷酸氢二钾对油松枯梢病的抑制率分别为98.77%和95.51%。

表1 不同药剂对油松枯梢病菌丝生长的影响Tab.1 Effect of four fungicides on the mycelial growth of S.sapinea

2.2 4种药剂对油松枯梢病菌丝生长的室内毒力测定分析

由表2可以看出,亚磷酸、硼酸、亚磷酸二氢钾和亚磷酸氢二钾4种药剂对油松枯梢病抑制率的EC50值均随时间的增加而增大,说明其持效性较差。即各药剂对油松枯梢病抑制率的EC50值在第3d最小,其中亚磷酸的EC50值最小,为0.374,硼酸的EC50值为1.669,亚磷酸二氢钾的EC50值为6.136,亚磷酸氢二钾的EC50值最大,为7.360。

由此可知,4种药剂对油松枯梢病菌丝生长均有抑制作用,抑制作用由强到弱为亚磷酸＞硼酸＞亚磷酸二氢钾＞亚磷酸氢二钾,并且亚磷酸的速效性和持效性都优于其他3种药剂。

表2 不同药剂对油松枯梢病病菌菌丝生长的室内毒力测定Tab.2 The toxicity of four fungicides on mycelial growth of S.sapinea in laboratory

2.3 不同药剂对松树枯梢病孢子萌发的影响

由表3可以看出,亚磷酸、硼酸、亚磷酸二氢钾和亚磷酸氢二钾4种药剂对油松枯梢病的孢子萌发率均有抑制作用,抑制率均随各药剂浓度的增加而增大,且随时间的延长而增加。即各药剂浓度对油松枯梢病孢子萌发的抑制率在24h最高。浓度为2g/L的亚磷酸对油松枯梢病的抑制率在24h为99.41%,浓度为3g/L的硼酸对油松枯梢病的抑制率在24h为99.54%,浓度为22.4g/L亚磷酸二氢钾及亚磷酸氢二钾对油松枯梢病的抑制率在24h分别为75.87%和50.84%。

表3 4种药剂对油松枯梢病孢子萌发的影响Tab.3 Effect of four fungicides on spore germination of S.sapinea

2.4 不同药剂对油松枯梢病孢子萌发室内毒力测定分析

由表4可以看出,亚磷酸、硼酸、亚磷酸二氢钾和亚磷酸氢二钾4种药剂对油松枯梢病孢子萌发抑制率的EC50值均随时间的增加而减小,说明持效性好,即各药剂对油松枯梢病孢子萌发抑制率的EC50值在24h最小,其中亚磷酸的EC50值最小,为0.587,硼酸的EC50值为1.043,亚磷酸二氢钾的EC50值为4.636,亚磷酸氢二钾的EC50值最大,为19.058。结果表明,4种药剂对油松枯梢病孢子萌发均有抑制作用,且抑制作用由强到弱为亚磷酸＞硼酸＞亚磷酸二氢钾＞亚磷酸氢二钾,其中亚磷酸的速效性最好。

3 结论与讨论

松树枯梢病是松树上比较严重的病害,不仅影响松树生长,还影响它的观赏价值,选择防治松树枯梢病的高效低毒药剂可以弥补传统化学药剂的不足。本研究对亚磷酸、硼酸、磷酸二氢钾以及磷酸氢二钾4种药剂对油松枯梢病的影响结果表明,4种药剂对油松枯梢病菌丝生长及孢子萌发均有一定的抑制作用,且菌丝生长抑制率的筛选结果与对孢子萌发抑制率的筛选结果大致相同,抑制作用由强到弱依次为亚磷酸、硼酸、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。

亚磷酸对菌丝生长和孢子萌发抑制效果最好,但其抑菌机制还需要进一步的试验研究。硼酸对松树枯梢病的抑制作用也较好,其抑菌机理可能是通过引起病原菌细胞内活性氧代谢紊乱,破坏线粒体的功能,导致蛋白质氧化损伤,抑制病原菌细胞外水解酶的分泌[11-19]。Qin等[6]的研究表明,硼酸能够直接破坏病原菌的质膜,导致胞内物质的渗漏。亚磷酸二氢钾以及亚磷酸氢二钾对松树枯梢病的抑制作用则可能是因为亚磷酸盐不仅可以直接作用于病原菌,还能刺激宿主产生防御反应[20]。虽然本研究中亚磷酸和硼酸对松树枯梢病菌的抑制作用较强,但在实际应用中,亚磷酸有腐蚀性,对皮肤及呼吸道均有刺激性,所以要慎重使用,而硼酸也能够刺激皮肤,其生物安全性需要进一步探讨评估。

本研究为亚磷酸、硼酸、亚磷酸二氢钾以及亚磷酸氢二钾4种药剂对松树枯梢病的防治奠定了基础,之后可以对4种药剂的抑菌作用机制以及各种抑菌物质的复配效果进行探索研究。但本研究仅在室内完成,其林间应用效果以及未来的产业化应用还需要进一步的林间试验。