赵 杨，王 沛，冯竟翠，谭书院，于 波

（长春中医药大学药学院，长春 130117）

连钱草属于唇形科植物活血丹的干燥地上部分，别名金钱草、透骨消等，具有清热解毒、利尿排石、散瘀消肿的功效，用以治疗热淋、尿路结石、肝胆结石、湿热黄疸等疾病[1]。主要化学成分有萜类、黄酮和黄酮苷类、有机酸类、挥发油类、甾体类、醇类等。其中萜类包括齐墩果酸、熊果酸等；黄酮和黄酮苷类包括木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、芫花素、槲皮素、连钱草酮等[2-5]。微丸是一种新的剂型，由药物与辅料构成的直径＜2.5 mm的球状实体。体积较小从而提高药物与肠胃的接触面积，同时具有载药量大的优点，可以通过不同释药速率的几种小球的组合，得到理想的释药速率、相对稳定的血药浓度，并维持较长的药物作用时间，避免对胃黏膜刺激等一些不良反应[6-7]。

1 材料

1.1 仪器 E-35型挤出制粒机：重庆英格制药机械有限公司；R-250型滚圆机：重庆英格制药机械有限公司；TU-1810型紫外分光光度仪：北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-250型超声波清洗器：江苏省昆山市超声仪器有限公司；RCZ-6C2型药物溶出度仪：上海黄海药检仪器有限公司。

1.2 试药 连钱草（批号1602001）：河北全泰药业有限公司；连钱草总黄酮（自制；质量分数为65.59%）；微晶纤维素：天津市光复精细化工研究所；芦丁（批号：013344，规格：分析标准品，HPLC≥98% 100 mg）：上海源叶生物科技有限公司；亚硝酸钠（批号：011516）：天津市光复科技发展有限公司；硝酸铝（批号：011755）：国药集团化学试剂有限公司；乙醇、氢氧化钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取与制备

2.1.1 连钱草总黄酮的提取与纯化 提取：将500 g连钱草药材烘干后，在粉碎机中粉碎得粗粉，用45%乙醇按液固比12:1的比例混合，放入超声机中超声2 h，设置温度为40 ℃，得连钱草总黄酮[8]。纯化：将D101型大孔树脂湿法装柱，加连钱草总黄酮以1 mL/min的速度进行动态吸附，用乙醇30%洗脱，收集洗脱液，并在水浴浓缩成浸膏。干燥：将浓缩后的浸膏干燥成粉，得连钱草总黄酮粉，测量吸光度计算总黄酮含量为65.59%。

2.1.2 连钱草黄酮微丸制备工艺 将得到的连钱草总黄酮与微晶纤维素混合，并用水做为黏合剂使其达到手握成团，触之即散的理想状态，在一定的挤出滚圆时间与速度制备出微丸，并筛分出30～40目的微丸进行研究。微晶纤维素具有很强的溶胀性和可塑性，与其他的辅料相比较，微晶纤维素制成的微丸有更高的硬度和强度，且成丸容易，不会出现微丸崩裂现象，是普通微丸最常用的一种赋形剂，也是挤出滚圆的技术中最重要的一种辅料。所以本品采用微晶纤维素做为辅料。

2.2 含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（约含芦丁0.2 mg/mL）[9]。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取连钱草总黄酮微丸适量研磨成粉末，取粉末1 g，置于100 mL密封容器中，精密加入50 mL 60%乙醇，密塞，称重，超声提取2 h，密塞，再次称重，续用60%乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，即得供试品[10]。

2.2.3 吸收波长的确定 取芦丁对照品溶液5 mL于25 mL容量瓶中，加蒸馏水6 mL，取5% NaNO3溶液1 mL，摇匀，放置6 min；加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀，静置6 min；再加入4% NaOH溶液1 mL，定容，摇匀，静置15 min，以同法作空白，在400～700 nm 波长范围内扫描。在505 nm处有最大吸收峰[11]。

精密吸取供试品溶液6 mL于25 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，后再去稀释后的供试品溶液5 mL，同上操作进行波长扫描，在505 nm处有最大吸收峰。

2.2.4 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液0、1、2、3、4、5、 6 mL于25 mL容量瓶中，加蒸馏水6 mL，取5% NaNO3溶液1 mL，摇匀，放置6 min；加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀，静置6 min；再加入4% NaOH溶液1 mL，最后加入蒸馏水到刻度，摇匀，静置15 min，在505 nm处测定，得回归曲线方程为：C = 0.093 07A - 0.008 5，r = 0.999 3。表明在8.000 0～48.000 0 µg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系[12]。

2.3 考察指标的测定

2.3.1 收率 即经过30～40目筛分的微丸与制备所得的微丸的比值。

2.3.2 圆整度 采用平面临界稳定法测定微丸的圆整度，即将微丸放在一平板上，缓慢抬起平板一侧，当80%微丸的滚动时，测量微丸开始滚动时倾斜平面与水平面所成的夹角，其角度越小，表明微丸的圆整度越好。

2.3.3 总黄酮含量 以芦丁对照品绘制标准曲线，测定总黄酮含量。

2.4 单因素试验及结果

2.4.1 投药量的考察 选择投药量为15%、35%、45%进行考察，起初先用了15%的投药量进行混合，当投药量少时，药物与辅料与黏合剂混合后偏干，使挤出物在切割滚圆时切割成粉，成丸率低。当投药量为35%时，药物本身黏度增大，与辅料混合后挤出物黏度适中，滚圆后成型率大。当投药量为45%时，由于药物本身黏度过大，造成挤出物过黏，经切割滚圆后成棒状，球状较少，所以本试验使用投药量在35%左右。

2.4.2 用水比例的考察 称取制得的药粉制软材，按2:1的比例加水混合，药物仍呈粉末状。加入1:2比例的水，药粉末已成黏糊状。所以加水量的范围就可以确定在这2个比例中间，经多次试验结果表明，最适宜的药水比例为1:1，制出的软材可以很好的制成微丸。

2.4.3 滚圆速度 将挤出好的挤出物置于滚圆机中，选择50 Hz进行滚圆，结果发现速度过快，导致药物全部贴至滚圆机内壁，无微丸形成，后又选择20、30、40 Hz进行滚圆，试验发现30 Hz时微丸的圆整度最好[7]。

2.4.4 滚圆时间 滚圆时间对微丸的圆整度和粒径都有很大的影响，滚圆时间短，滚圆的圆整度则降低，收率减少；滚圆的时间过长，则滚圆的圆整度较好，但粒径变小，使微丸的形态变小，得不到较好的微丸。所以要在一定的时间范围内，制备出圆整度好，收率大的微丸。本品中固定微晶纤维素，投药量为35%，用水量为1:1，采用的滚圆时间为30、50、70 s。考察其对圆整度的影响。实验发现，当滚圆时间短时，圆整度大，滚圆效果较差，当时间增加则圆整度小，滚圆效果较好。

2.5 正交设计试验 根据单因素考察的结果，控制连钱草总黄酮与微晶纤维素的比约在15%～45%内，用水量控制在2:1～1:2之间，根据实验操作，把微晶纤维素固定。选定投药量（A）、物料与水比例（B）滚圆时间（C）、滚圆速度（D）4个因素为考察对象，每个因素定3个水平[10]。

采用综合加权评分的方法对工艺进行优化。根据实验的目的，指标微丸的重要性从大到小为：总黄酮含量（y1）＞收率（y2）＞圆整度（y3）。所以权重系数分别取为60%、30%，10%。结果可知，四因素对连钱草总黄酮微丸影响的顺序为A＞B＞D＞C，其中载药量的影响最显著，其次为用水量，而滚圆速度与时间则影响较小。筛选出的最优处方为A2B2C3D1，即投药量为35%，用水量为1:1，滚圆时间为70 s，滚圆速度为20 Hz。正交试验L9（34）及结果，见表1，方差分析及结果，见表2。

表1 正交试验L9（34）及结果

表2 方差分析及结果

由方差分析结果可知，四因素对连钱草总黄酮微丸影响的顺序为A＞B＞D＞C，其中载药量的影响最显著，其次为用水量，而滚圆速度与时间则影响较小。从直观分析可知A因素的2水平，B因素的2水平，C因素的3水平，D因素的2水平为最佳水平：A2B2C3D2，即投药量为35%，用水量为1:1，滚圆时间为70 s，滚圆速度为30 Hz。

2.6 验证性试验 取连钱草总黄酮3份，按最佳工艺制备微丸，考察收率、圆整度及总黄酮量。所以实验结果表明：3批连钱草微丸总黄酮含量的RSD为0.33%，重复性良好。

2.7 方法学考察

2.7.1 重复性试验 平行取6份样品，按2.2.2项下制备供试品溶液，精密吸取4 mL，按2.2.4项下操作，进样测定，结果RSD为0.125%，结果表明，重现性良好。

2.7.2 精密度试验 分别吸取对照品溶液及重复性试验项下的供试品溶液各1份，测定吸光度。RSD分别为0.1375和0.207%，结果表明，精密度良好。

2.7.3 稳定性试验 精密吸取重复性试验项下供试品溶液1份，按0、5、10、15、20、25 min连续测定吸光度，RSD为0.280%，结果表明，供试品溶液在25 min内稳定性良好。结果可靠。

2.7.4 加样回收率试验 取已知含量的同一批样品6份，精密称定，分别加入芦丁对照品，按供试品溶液方法制备，测定，计算回收率，平均回收率为98.05%，RSD为1.88%，回收率良好，适合作为本品的含量测定。

2.8 连钱草总黄酮体外释放度检测 取自制缓释微丸，按照《中华人民共和国药典》（2015版第4部）通则9013以释药率对时间作图，见图1。图1在《中华人民共和国药典》（2015版第4部）9014微粒制剂指导原则中规定在开始0.5 h内的释放量要求低于40%，且最后释放率在90%以上。

图1 连钱草总黄酮体外释放度曲线

根据体外释放曲线可知，优化工艺制备的微丸在0.5 h内累积释药率为27.3%，6 h时的累积释药率为92.5%，符合药典规定，微丸释放度良好。

2.9 释药模型拟合 连钱草总黄酮微丸在磷酸盐缓溶液中，以零级释药模型、一级释药模型和Higuchi释药模型进行拟合。

以磷酸盐缓冲溶液为释药介质，用Higuchi释药方程拟合，r = 0.918 3为最大值。因此，认为连钱草总黄酮微丸在磷酸盐缓冲溶液中的Higuchi方程为最佳释药模型拟合方程。零级方程与一级方程得到的r值远小于Higuchi方程。

3 小结

本文运用挤出滚圆法制备连钱草总黄酮微丸，通过单因素实验考察投药量、用水量、滚圆时间、滚圆速度对微丸的影响进行正交，得出最佳方案：投药量35%；用水量1:1；滚圆时间70 s；滚圆速度30 Hz。并以最佳工艺测定其累积释药率，得到符合《中华人民共和国药典》的结果。