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海带内生真菌Galactomyces geotrichum次生代谢产物改善小鼠的学习记忆能力

2018-08-19刘佳田淑娟仇宏伟王凤舞

现代食品科技 2018年7期
关键词:活力肝脏培养基

刘佳,田淑娟,仇宏伟,王凤舞

(1.青岛农业大学食品科学与工程学院,山东青岛 266109)(2.青岛农业大学学报编辑部,山东青岛 266109)

阿尔茨海默病(AD)是一种神经系统退行性疾病。其临床表现为记忆力减退、认知功能发生障碍、行为异常和社交障碍[1]。阿尔茨海默病发病机制十分复杂,有关病因学说颇多,其中包括胆碱能缺失学说、基因突变学说、氧化应激学说和炎症因子学说等[2]。胆碱能缺失学说认为神经递质乙酰胆碱的缺失,胆碱酯酶活性的增强和胆碱乙酰转移酶活性的减弱打破脑内平衡,发生AD[3,4]。氧化应激学说认为AD患者存在较高水平的DNA和RNA氧化损伤,脂质过氧化反应,蛋白质氧化修饰及其它氧化应激损伤,大脑内部自由基氧化损伤是导致阿尔茨海默病的关键原因[5,6]。目前为止临床上使用最广泛的药物,主要为单靶向的乙酰胆碱酯酶抑制剂,如他克林、多奈哌齐、卡巴拉汀等,但疗效不是很理想且多数价格昂贵[7],筛选具有抑制AchE活性和抗氧化双重功能的活性物质具有很重要的意义,它既能提高AD患者大脑中Ach的含量,促进胆碱能神经系统功能的恢复,提高AD患者的认知,又能保护大脑,延缓AD病人神经系统退化。植物真菌的次生代谢产物是天然活性物质的重要来源,海带中含有降血压、抗疲劳耐缺氧、抗氧化和抑菌抗病毒等多种功能的活性成分,而与海带互利共生的内生真菌产生的次生代谢产物中可能会有能够加以利用的功能成分。

在前期试验中,我们课题组从海带中分离出内生真菌 QDFBLJ-1,发现其代谢产物的乙酸乙酯相有较强的体外抗抑制乙酰胆碱酯酶和抗氧化的活性。因此本试验以内生真菌QDFBLJ-1次生代谢产物为研究对象,采用 D-半乳糖致衰老模型小鼠,进行 Morris水迷宫实验和测定小鼠血清、肝脏和脑部组织 CAT、SOD、MDA、GSH-Px及脑部组织AchE、ChAT的变化,以探讨其对AD模型鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SPF级昆明种小鼠80只,体重20~22 g。购自青岛大任富城畜牧有限公司,许可证号:SCXK(鲁)20140007。

1.2 材料试剂与仪器

海带内生真菌 Galactomyces geotrichum QDFBLJ-1,由青岛农业大学中韩食品生物技术研究所从青岛海域海带中分离获得;CAT测试盒、SOD测试盒、GSH-Px测试盒、MDA测试盒、AchE测试盒、ChAT测试盒、总蛋白测试盒,均购于上海源叶生物科技有限公司;他克林、抗坏血酸、D-半乳糖,均购于美国sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。

DU-800型紫外分光光度计,美国贝克曼公司;TGL-16M高速台式冷冻离心机,湖南湘仪离心机仪器有限公司;iMark酶标仪,美国bio-rad有限公司;Morris水迷宫,北京众实迪创科技发展有限责任公司;旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;恒温振荡器ISRDH1,苏州麦可旺志生物技术有限公司;电子分析天平,美国奥豪斯电子天平公司;移液枪,法国GILSON公司。

1.3 实验方法

1.3.1 海带内生真菌Galactomyces geotrichum QDFBLJ-1代谢产物乙酸乙酯相与培养基浸提物的制备

选用从青岛海域海带中分离得到的一株内生真菌QDFBLJ-1进行液体发酵,培养基为察氏培养基,接种量为10%,28 ℃培养14 d。发酵结束后,用4层无菌纱布过滤,得到过滤液。将过滤液和察氏培养基分别经旋转蒸发仪浓缩,乙酸乙酯萃取3次,合并萃取相,得待测样品浸提物和培养基浸提物。

1.3.2 实验分组及造模方法

小鼠经3 d适应性喂养后,随机分为8组,每组10只。分别为:空白对照组、模型对照组、他克林阳性对照组、Vc阳性对照组、乙酸乙酯相低、中、高剂量组。除空白组,其余各组每日皮下注射360 mg/(kg bw·d)D-半乳糖,空白组皮下注射等体积生理盐水。他克林和Vc阳性对照组按10 mg/(kg bw·d)灌胃并使其灌胃量与空白组、模型组相同。乙酸乙酯相低、中、高剂量组分别按 13 mg/(kg bw·d)、38 mg/(kg bw·d)和63 mg/(kg bw·d)灌胃,培养基浸提物对照组按 63 mg/(kg bw·d)灌胃,空白组和模型组每日灌胃等体积生理盐水。小鼠饲养温度为18~22 ℃,自然光照,自由进食和饮水。每日定时灌胃、皮下注射一次,连续饲喂6周,记录小鼠体重增加量。

1.3.3 Morris水迷宫实验

定位航行实验使用Morris水迷宫[8]测定小鼠的学习和记忆能力。第43 d开始进行试验,共4 d。实验开始前小鼠自由游泳2 min。正式实验每天训练2次,每次120 s,随机选择东、南、西、北4个象限中的一个,将小鼠面向池壁放入水中,记录小鼠寻找并爬上平台所需时间,该时间即为逃避潜伏期。如果实验小鼠在120 s内未找到平台,则由实验者将其引至平台,停留30 s,该实验小鼠的逃避潜伏期记为120 s。每只小鼠训练次数共8次。计算每天各组小鼠2次逃避潜伏期。

空间搜索实验用于测定小鼠对平台空间位置的记忆保持能力。试验小鼠训练4 d后,于第5 d将平台撤离,选取平台所在象限的对侧将小鼠放入池中,使小鼠在水中游泳120 s,记录120 s内小鼠经过平台所在象限的停留时间以及穿越平台所在象限的次数。

1.3.4 生化指标测定

在空间搜索实验后将小鼠禁食12 h,称重。摘除眼球取血处死,加入抗凝血剂,静置3 h后,血样在4 ℃下5000 r/min离心10 min,收集上清液即血清;取血后立即解剖小鼠,迅速取出肝脏和脑部用生理盐水清洗,用滤纸吸干,将肝脏和脑部组织研磨,以制备10%匀浆液(匀浆过程始终处于冰水中),在4 ℃下5000 r/min离心10 min后除去细胞碎片,取上清液备用[9]。按照试剂盒说明书测定血清、肝脏和脑部组织SOD、GSH-Px、CAT酶活力及MDA含量以及小鼠脑部AchE和ChAT活性。

1.4 数据处理

实验数据采用SPSS 18.0软件进行分析,平均值±标准差(¯x±s)来表示,组间均值比较采用单因素方差分析和Duncan多重比较分析,显著性水平p=0.05。

2 结果与讨论

2.1 Morris水迷宫实验结果

2.1.1 小鼠体重变化结果

表1 小鼠体重增加量Table 1 The result of mice weigh gain

模型建造期间,空白对照组仅体重稳定增加,其他指标无变化。体重测定结果表明:8组小鼠处死前与给药前相比体重均有所增加,无显著性差异,表明小鼠身体除氧化损伤、痴呆方面,其他各项机能基本稳定。模型对照组小鼠和浸提物对照组小鼠体重亦增加,但活动量减少,精神萎靡,反应迟钝。说明 D-半乳糖对小鼠体内氧化应激反应剧烈,造成氧化损伤、小鼠身体衰老、大脑痴呆,初步表明建模成功。

2.1.2 对AD模型小鼠学习和记忆能力的影响

定位航行试验:培养基浸提物对照组与模型对照组基本一致,无显著性差异。说明培养基浸提物对小鼠的学习记忆能力无改善影响。各组小鼠随着训练时间的延长,逃避潜伏期均有所缩短。与空白组相比,模型组逃避潜伏期明显高于空白组小鼠(p<0.05)。与模型组相比,他克林、Vc阳性对照组明显延长于模型对照组(p<0.05),中、高剂量组逃避潜伏期与模型对照组差异性显著(p<0.05)。随着样品剂量的增加,受试动物组中小鼠的逃避潜伏期相对应缩短。与Vc阳性对照组相比,高剂量组逃避潜伏期与其差距较小,说明待测样品尤其是高剂量组有增强 D-半乳糖模型小鼠学习记忆能力的作用。

空间探索实验:培养基浸提物对照组与模型对照组基本一致,无显著性差异。撤出平台后,与模型组相比,空白组在Morris水迷宫穿越平台次数和象限停留的时间明显延长(p<0.05)。阳性对照组和低、中、高剂量组穿越平台次数与模型对照组差异显著(p<0.05),高剂量组穿越平台次数大于Vc阳性对照组,且与他克林阳性对照组基本一致。阳性对照组和高剂量组平台象限时间明显延长于模型对照组(p<0.05)。随着待测样品剂量的增高,受试动物组有逐步延长的趋势。说明待测样品尤其是高剂量组有改善D-半乳糖模型小鼠对空间位置记忆能力作用趋势。

表2 定位航行和空间探索结果Table 2 The result of locates the navigation and easpace exploration experiment

2.2 生化指标测定结果

2.2.1 QDFBLJ-1次生代谢产物对小鼠血清、肝脏和大脑组织MDA含量的影响

从表3可知,培养基浸提物对照组与模型对照组基本一致,无显著性差异。模型组小鼠血清、肝脏和大脑中MDA含量显著高于空白组(p<0.05),说明建模成功。与模型组相比,阳性对照组和组织中、高剂量组MDA含量明显降低(p<0.05)。

与Vc阳性对照组相比,高剂量组小鼠的肝脏和大脑组织中MDA含量均少于Vc阳性对照组,表明抗氧化效果优于Vc阳性对照组。低、中、高剂量组与模型对照组相比,血清中 MDA含量分别下降8.29%、12.71%和16.71%,肝脏组织中MDA含量分别下降17.75%、20.41%和46.08%,大脑组织中MDA含量分别下降14.95%、28.47%和36.48%。说明样品组尤其是高剂量组能够抑制肝脏和大脑组织中的脂质过氧化,延缓衰老。

表3 小鼠血清、肝脏和大脑MDA含量Table 3 MDA content of serum, liver and brain in mice

2.2.2 QDFBLJ-1次生代谢产物对小鼠血清、肝脏和大脑组织SOD活力的影响

由表4可知,培养基浸提物对照组与模型对照组基本一致,无显著性差异。与空白组相比,模型组小鼠血清、肝脏和脑部组织中 SOD酶活力明显降低(p<0.05)。

与Vc组相比,高剂量组小鼠大脑组织SOD活力较高。与模型对照组相比,低、中、高剂量组小鼠血清、肝脏和脑部组织中 SOD活力高于模型组,且各组织中、高剂量组与模型组差异显著(p<0.05)。样品组血清中 SOD活力分别上升 15.71%、20.37%和25.97%,肝脏组织中分别上升 8.00%、21.35%和28.91%,大脑组织中分别上升 10.86%、26.06%和40.23%。可以看出样品组尤其是高剂量组能够有效清除大脑内超氧离子自由基,减少大脑氧化损伤,延缓衰老。

表4 小鼠血清、肝脏和大脑SOD活力Table 4 SOD activity of serum, liver and brain in mice

表5 小鼠血清、肝脏和大脑GSH-Px活力Table 5 GSH-Px activity of serum, liver and brain in mice

2.2.3 QDFBLJ-1次生代谢产物对小鼠血清、肝脏和大脑组织GSH-Px活力的影响

由表5可知,培养基浸提物对照组与模型对照组基本一致,无显著性差异。模型组小鼠血清、肝脏和脑部组织中 GSH-Px活力较空白对照组显著降低(p<0.05)。与模型组相比,与Vc组相比,小鼠血清高剂量组GSH-Px活力较高。小鼠血清中、高剂量组和肝脏高剂量组以及大脑中、高剂量组中GSH-Px活力显著降低(p<0.05)。血清中低、中、高剂量组GSH-Px分别升高26.00%、40.90%和52.60%,肝脏组织中、高剂量组分别升高11.52%和22.30%,大脑组织中分别升高6.06%、27.38%和39.41%。可以看出,样品组能够较好的催化血清中还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应,保护细胞膜结构和功能完整。

2.2.4 QDFBLJ-1次生代谢产物对小鼠血清、肝脏和大脑组织CAT活力的影响

由表6可知,培养基浸提物对照组与模型对照组基本一致,无显著性差异。模型组小鼠肝脏、脑部组织和血清中 CAT活力较空白对照组显著降低(p<0.05)。与Vc组相比,小鼠血清高剂量组CAT活力较高。与模型组相比,血清高剂量组中CAT活力与模型组差异显著(p<0.05),血清中低、中、高剂量组CAT活力分别上升4.16%、18.94%和29.79%,肝脏组织中分别上升14.11%、26.13%和33.43%,大脑组织中分别上升7.89%、25.41%和34.29%。可以看出,样品最对肝脏和大脑中CAT活力提高较多,尤其是高剂量组能够较好的分解大脑中的过氧化氢,减少氧化应激反应,延缓大脑衰老。

表6 小鼠血清、肝脏和大脑CAT活力Table 6 CAT activity of serum, liver and brain in mice

2.2.5 QDFBLJ-1次生代谢产物对小鼠大脑AchE、ChAT活力的影响

表7 小鼠大脑AchE、ChAT活力Table 7 Activity of AchE and ChAT in mouse brain

由表7可知,培养基浸提物对照组与模型对照组基本一致,无显著性差异。与空白组相比,模型组小鼠大脑AchE活性显著升高(p<0.05),ChAT活性显著降低(p<0.05),说明建模成功,可以认为 D-半乳糖导致小鼠衰老和记忆障碍的机制之一是胆碱能系统损伤。与模型对照组相比,小鼠脑部低、中、高剂量组AchE活性明显降低(p<0.05),其中高剂量组AchE活性升高了28.64%。小鼠大脑中、高剂量组ChAT活性明显升高(p<0.05),低剂量组已提高 ChAT活力92.79%。说明样品对于胆碱能系统的损伤修复,主要是Ach的合成,神经递质增多,从而抑制老年痴呆。与他克林阳性对照组相比,小鼠大脑高剂量组 AchE活力低于阳性对照组,ChAT活力高于阳性对照组。说明该菌株次生代谢产物尤其是高剂量组可以在一定程度上改善 D-半乳糖对小鼠大脑造成的胆碱能系统损伤,提高小鼠的学习和记忆能力。

3 结论

3.1 本实验中,Morris水迷宫行为学实验评价 G.geotrichum QDFBLJ-1次生代谢产物对小鼠学习记忆力有改善作用。研究表明,培养基浸提物对照组与空白组基本一致,无显著性差异,排除培养基浸提物对实验的影响。在定位航行与空间探索实验中,三个样品剂量组较衰老模型组相比逃避潜伏期缩短、穿越平台次数增加、平台象限时间增加,以高剂量组的效果尤为显著。

3.2 氧化应激和中枢胆碱功能损伤是神经性退行疾病中认知功能减退的主要原因之一。MDA是机体内的自由基引发脂质过氧化的一种产物,能够间接反映细胞损伤程度和机体过氧化水平[10]。SOD是体内一种重要的抗氧化酶,能够有效清除超氧阴离子自由基,降低MDA及自由基代谢产物的产生,使细胞免受破坏[11]。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶,它催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应,能够保护细胞膜结构和功能完整,缓解机体内的氧化损伤[12]。CAT是存在于红细胞和某些组织内的过氧化体中,催化H2O2分解为H2O与O2,延缓机体衰老[13]。因此本实验选用SOD、MDA、GSH-Px、CAT作为评估抗氧化作用的指标。Ach是大脑中枢系统内与学习记忆相关的重要神经递质,能特异性的作

用于各类胆碱受体,其含量与ChAT和AchE活性有关,AchE分解Ach,ChAT则是催化Ach合成的限速酶,二者相互作用共同维持脑内Ach量的动态平衡[14],通过检测其活性可以间接推测出Ach含量的高低[15]。因此本实验选择AchE和ChAT作为评估胆碱能神经系统活性的指标。结果表明,G. geotrichum QDFBLJ-1次生代谢产物显著提高了小鼠血清、特别是肝脏和脑部组织中SOD、CAT、GSH-Px水平、降低MDA水平,而且能够显著降低小鼠脑部组织AchE活性,提高ChAT活性,部分高剂量组效果优于阳性对照Vc。说明G. geotrichum QDFBLJ-1次生代谢产物能够降低氧化应激程度,减轻自由基对脑组织的损伤,延缓大脑衰老,恢复小鼠中枢胆碱功能,从而改善D-半乳糖所致衰老模型小鼠的学习记忆能力。

3.3 本课题组多年来致力于从海洋微生物中寻找具有抑制乙酰胆碱酯酶和抗氧化双重活性的功能活性物质,以期开发新型的抗AD天然药物。通过本次实验可以看出,海带内生真菌白地霉 G. geotrichum QDFBLJ-1次生代谢产物属于实际无毒,其乙酸乙酯相有抗氧化损伤和抑制乙酰胆碱酯酶的双重活性,能够改善D-半乳糖致AD模型小鼠学习记忆能力。说明调节中枢胆碱能系统、保护神经元细胞、提高机体自由基清除能力和抗脂质氧化损伤可能是改善AD模型小鼠学习记忆能力的作用机制之一。目前国内外有关海带内生菌的研究报道仅见于海带内生菌DNN6蛋白对小黄鱼的保鲜效果[16]和抗肿瘤活性[17],DNN7蛋白的分离及抗肿瘤研究[18]以及HSN2胞外蛋白对粉红单端孢霉的影响[19],未发现关于海带内生菌的抗老年痴呆相关活性报道。因此本次研究对开发新型的抗 AD天然药物具有重要意义。

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