拟南芥热形态建成中PIF4下游基因研究

2018-08-18汪硕丁岚刘建祥韩佳嘉

生物技术通报 2018年7期

汪硕丁岚刘建祥，2 韩佳嘉，2

（1. 复旦大学生命科学学院，上海 200433；2. 浙江大学生命科学学院，杭州 310027）

随着温室效应的加剧，近些年全球气候逐渐变暖，20世纪全球平均气温约提高0.6℃［1］，经预测，到2050年平均温度将可能提高2-5℃［2］。高温会对植物的生长发育产生直接影响，在较高环境温度下植物会出现叶片偏下、开花提前及下胚轴伸长等表型，与光形态建成对应，植物在环境温度升高条件下的一些形态上的改变被称为热形态建成（thermomorphogenesis）。现有研究表明，调控这些表型的信号途径与植物遮荫下的分子信号途径多有重叠，表型也十分类似［3］。

光和环境温度作为最重要的环境信号，极大地影响了植物的生长发育。光敏色素互作因子（Phytochrome interacting factors，PIFs），是一类可以与光受体光敏色素蛋白相互作用的bHLH家族转录因子。PIFs在光调控的植物生长发育过程中十分重要，能够影响植物的下胚轴伸长、幼苗的暗形态建成、促进避荫反应等［4］。29℃的温和高温（mild high temperature）能诱导拟南芥野生型幼苗下胚轴伸长，而PIF4缺失突变体pif4对温和高温不敏感，下胚轴几乎不伸长［4］。隐花素（cryptochrome，CRY）是光裂解酶类似的蓝光受体，在拟南芥苗期主要调控其下胚轴伸长。CRY1对温度响应十分重要，而温和高温下CRY1通过与PIF4以蓝光依赖的形式相结合，进而调控PIF4在温和高温下的转录活性［5］。最近，有报道指出光敏色素B（phyB）不仅可作为光的受体，同时能感应环境温度的变化［6］，但温和高温下phyB到PIF4的信号传递目前不是很清楚。

另外一条独立于PIF4的调控植物响应光和温度信号，控制下胚轴伸长的信号通路包含COP1（CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1）和HY5（ELONGATED HYPOCOTYL 5）。HY5是 bZIP家族转录因子，不但在白光下抑制拟南芥下胚轴伸长，同时在常温下也能通过与PIF4竞争下游靶标基因启动子来抑制下胚轴伸长［7］。在黑暗条件下或环境温度升高后，HY5被泛素连接酶COP1降解，从而解除了HY5 对下胚轴伸长的抑制效果［7-10］。COP1在细胞核中发挥作用，但温和高温下COP1如何进核的分子机理目前不清楚。

温度的升高会使生长素表达水平上升，进而调节下胚轴伸长等植物生长活动［11］。有研究表明当温度升高时，拟南芥中生长素响应基因表达水平也有所变化［12］。拟南芥在响应温和高温时，PIF4能够直接结合生长素合成基因，如YUC8，TAA1，CYP79B2等基因的启动子。PIF4通过激活TAA1和CYP79B2基因的表达，进而介导吲哚乙酸（IAA）的合成［13］。而IAA的积累能够促进AUX/IAA蛋白的降解，进而消除对ARF蛋白的抑制作用。最后ARF通过激活SAUR19等基因的表达促进胚轴伸长［14］。其它植物激素，例如，油菜素内脂BR和赤霉素GA在植物热形态建成中也发挥着重要的作用［12，15-17］。

本实验利用拟南芥PIF4缺失突变体和PIF4过表达等材料开展研究。遗传分析表明，PIF4、PIF5和PIF7中，PIF4在热形态建成中的作用最重要。通过对RNA-Seq结果和结合CHIP-Seq分析找到了拟南芥热形态建成中PIF4调控的下游基因以及结合靶标基因。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所使用的植物材料有拟南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia生态型（Col-0），拟南芥Columbia背景突变体pif4-101，拟南芥野生型背景下PIF4∶PIF4-myc转基因植株，拟南芥pif4-101背景下PIF4∶PIF4，PIF4∶PIF5，PIF4∶PIF7转基因植株。所使用的菌株有大肠杆菌（Escherichia coli）TOP10，农杆菌菌株（Agrobacterium tumefaciens）GV3101。这些材料均为本实验室获得和保存。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥的平皿培养将同批收获的种子放于1.5 mL离心管中，用1 mL 体积比为50%的酒精迅速清洗1次，用体积比0.3%的NaClO消毒15 min后，于超净台内用无菌水清洗3次，播种在含质量浓度1.2%蔗糖的1/2MS固体培养基上。4℃春化2-3 d后置于22℃光照培养箱，光16 h/暗8 h。

1.2.2 下胚轴长度测量和分析将相应材料于22℃培养4 d后，在第5天光照开始时移至29℃培养4 d，以22℃培养的植物作为对照。用相机分别拍下对应天数的不同材料的拟南芥幼苗生长照片，利用ImageJ软件进行数据测量分析。

1.2.3 RNA-Seq 拟南芥Columbia野生型（wild-type，WT）和pif4-101突变体4℃春化2 d后于22℃培养7 d。在光照开始时将幼苗移至29℃处理1 d，以22℃培养的植物作为对照。于黑暗周期结束后收集拟南芥幼苗用于RNA-Seq。根据Illumina标准步骤构建cDNA文库，Illumian Hiseq3000测序（晶能公司）。GO 分析采用 AgriGO（v2.0）进行分析［18］。

1.2.4 染色质免疫共沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）分别将拟南芥Columbia野生型及PIF4∶PIF4-myc转基因植株于22℃培养，第12天29℃处理24 h，以22℃培养的植物作为对照。用甲醛固定液固定，后用2.5 mol/L甘氨酸解交联，MilliQ水清洗材料3次。去除水分，冻于-80℃保存。将材料用液氮研磨成粉末，加入30 mL EB1，用2层Miracloth过滤。离心后用1 mL EB2重悬，离心并用300 μL EB3重悬沉淀，并覆盖于600 μL EB3上。离心并用300 μL NLB重悬沉淀，使用biorupt进行超声，超30 s停30 s。离心取部分上清做Input。其余每个重复加入50 μL protein A beads去除与beads的非特异性结合。取上清加入2 μg myc抗体，于4℃旋转过夜。次日加protein A beads 110 μL，4℃ 2 h 后低速离心留 beads。分别用低盐、高盐和LiCl和TE缓冲液清洗beads。分两次加入300 μL 洗脱缓冲液65℃煮15 min，合并。用洗脱缓冲液将Input补齐到500 μL，与免疫沉淀后的DNA-蛋白复合物一起于65℃解交联约6 h。用蛋白酶K去除蛋白，RnaseI去除RNA。沉淀DNA，并用无水乙醇及70%乙醇清洗沉淀，晾干后用无菌水溶解。

以MYC抗体沉淀的DNA为模板，进行qPCR扩增，以actin启动子序列作为阴性对照。qPCR实验使用 SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）试剂，在Bio-Rad CFX96TM仪器上完成。反应体系按照TaKaRa及Bio-Rad CFX96TM仪器配制。得到数据后分析处理并作图。

1.2.5 实时荧光定量PCR实验（qRT-PCR） RNA提取使用植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN），总RNA保存于-80℃。cDNA使用 M-MLV（TaKaRa）反转录得到，保存在-20℃。

qRT-PCR实验使用SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）试剂，在Bio-Rad CFX96TM仪器上完成。反应体系按照TaKaRa及Bio-Rad CFX96TM仪器配制。得到数据后分析处理并作图。

2 结果

2.1 PIF4在拟南芥热形态建成中的主要生物学功能

本实验在拟南芥PIF4突变体pif4-101背景下采用PIF4自身启动子分别回补PIF4、PIF5和PIF7，利用这3种互补遗传材料来研究PIF4及同源蛋白在拟南芥热形态建成中的生物学功能的区别。野生型拟南芥和pif4-101、PIF4∶PIF5、PIF4∶PIF7在22℃生长8 d后，4种材料的幼苗下胚轴长度基本一致（图1-A），而PIF4∶PIF4的下胚轴则明显长于其他材料。而在22℃生长4 d、29℃生长4 d的条件下，PIF4∶PIF4的下胚轴伸长更长，野生型和PIF4∶PIF5的下胚轴比22℃时伸长的幅度接近，而pif4-101、PIF4∶PIF7则几乎不伸长（图1-B）。

基因表表达分析（图1-C）表明，PIF4∶PIF4植物中正常条件下PIF4表达量比野生型中高，可能是PIF4∶PIF4植物正常温度条件下下胚轴比较长的原因。这些结果表明，拟南芥热形态建成中PIF7的功能较小，PIF5也具有PIF4类似的功能，但PIF4的功能明显比PIF5的功能强。因此，PIF4在拟南芥热形态建成中具有重要的功能。

图1 PIF4突变体的表型遗传互补分析

2.2 热形态建成中PIF4调控的下游基因

为了在全基因组水平上理解热形态建成过程中PIF4调控的下游基因表达，将拟南芥野生型和突变体pif4-101在22℃ 培养7 d后，于光周期中白光开始时用29℃处理24 h，在黑暗结束后取样，以不处理的植物作对照，收集幼苗全苗进行转录组测序（RNA-Seq）。对转录组数据进行统计分析后显示，在拟南芥野生型与pif4-101中分别有602个基因和512个基因受温和高温处理上调，并有529个基因和484个基因受温和高温处理下调。其中有248个基因只在野生型中特异上调，198个基因只在野生型中特异下调（图2，附表）。

图2 PIF4突变体与野生型热处理的RNA-SEQ分析

对于这些只在野生型中上调的248基因，我们认为它们是PIF4依赖的热响应基因。GO分析（图3）显示，PIF4依赖的热响应基因中主要参与脱落酸响应、生长素响应、几丁质响应、脱水响应、盐胁迫、冷驯化等过程。综上所述，这些结果表明，PIF4依赖的热响应基因主要参与植物激素信号通路和逆境应答。

对于354个在野生型和突变体pif4-101中上调的下游基因，对其上调幅度也进行了比较。结果（表1）显示，有21个基因在pif4-101突变体中的上调倍数是野生型（WT）中上调倍数的1/2及以下，我们把这些基因视作是部分依赖PIF4调控的热形态建成基因。

2.3 热形态建成中PIF4调控的结合靶标基因

图3 PIF4依赖的热响应基因GO分析

表1部分依赖PIF4调控的热形态建成基因

为了检测上述PIF4依赖和部分依赖的基因是否是PIF4的直接靶标基因，我们在拟南芥野生型背景下过表达myc标签融合的PIF4-myc材料（PIFox）。野生型WT和PIF4ox-5、PIF4ox-8转基因材料在22℃正常生长8 d后，PIF4过表达转基因材料表现出下胚轴变长的表型。在22℃生长4 d后移入29℃培养4 d，野生型的下胚轴出现一定程度的伸长，PIF4过表达转基因材料下胚轴伸长现象更加明显（图4）。这表明PIF4过表达材料正常温度下可能已经激活部分下游基因，并且能响应环境温度升高的变化，这些材料可以用于后续结合靶标基因的实验。

图4 PIF4过表达的表型分析

在研究植物激素BR调控下胚轴伸长过程时，王志勇课题组采用pifq四突变体背景下自身启动子驱动的PIF4-myc过表达材料，正常生长条件下进行染色质共免疫沉淀深度测序（ChIP-Seq）分析，得到4583个候选的PIF4结合靶标基因［15-16］。

为了研究热形态建成中PIF4的结合靶标基因，我们比较了上述248个PIF4依赖的基因以及PIF4候选的结合靶标基因，得到70个热形态建成过程中被PIF4结合的候选靶标基因。

我们随机选择了7个靶标基因，包括AT1G29395（COR413IM1）、AT1G73120（F-box 蛋白）、AT2G47780（LDAP2）、AT3G28857（PRE5）、AT4G14130（XTR7）、AT5G07010（ATST2A）、AT5G18050（SAUR22），利用PIF4-myc过表达材料（PIFox-5）进行ChIP-qPCR实验。结果（图5）表明，AT1G29395、AT3G28857、AT5G18050这 3个基因的启动子区域在正常温度下就可以被PIF4-myc富集（≥1.5倍，P ＜ 0.05），在环境温度升高后7个候选靶标基因中，6个基因（AT1G29395、AT1G73120、AT2G47780、AT3G28857、AT5G07010、AT5G18050）的启动子区域被PIF4-myc富集（≥1.5倍，P ＜ 0.05），说明通过生物信息分析得到的70个PIF4结合靶标基因中绝大部分为实际PIF4结合靶标基因（附表）。

图5 PIF4体内结合下游基因启动子的分析

我们也比较了上述21个PIF4部分依赖的基因以及PIF4候选的结合靶标基因，得到4个PIF4热形态建成过程中被PIF4结合的靶标基因（表1）。我们把这74个PIF4结合靶标基因视作热形态建成中PIF4结合的靶标基因，这些靶标基因是否被PIF4直接结合可以采用凝胶迁移EMSA实验进行证明。

2.4 PIF4过表达对下游基因的影响

为了研究PIF4过表达对下游基因表达的影响，将野生型（WT）和PIF4-myc过表达材料（PIF4ox-5）进行不同温度处理，检测以上提到的7个基因的表达情况。结果（图6）表明，6个基因（AT1G29395、AT1G73120、AT2G47780、AT3G28857、AT4G14130、AT5G18050）正常温度下PIF4ox-5中的表达量高于野生型中的表达量，只有1个基因（AT5G07010）在温和高温处理后PIF4ox-5中表达量才高于野生型中的表达量。

图6 PIF4过表达对下游基因表达的影响

3 讨论

bHLH家族转录因子PIF4与关敏色素phyB互作，参与植物光形态建成，后续更多的研究表明，PIF4是植物热形态建成中的重要调控节点［19-23］。我们的实验结果也表明，在几个PIFs中，PIF4在植物热形态建成中功能最重要。PIF4基因的表达受时钟的调控，同时也受温和高温的诱导［20，24］。PIF4蛋白也受到翻译后修饰调控。例如，在白光下phyB和BIN2可以磷酸化PIF4，导致PIF4的降解［25-26］。环境温度升高后磷酸化的PIF4积累［27］，这主要与DET1稳定PIF4有关［7］。此外，PAR1和CRY1也可以与PIF4互作，温和高温下抑制PIF4 的转录活性［5，28-29］。

PIF4的靶标基因中有很多是植物激素合成和响应基因［12，15］，因此一般认为PIF4在热形态建成中主要通过植物激素，如生长素途径发挥作用［11，23］。事实上，生长素合成基因比如YUC8和生长素响应基因比如IAA4 和IAA29，受温和高温的诱导上调并且依赖于PIF4［13，20］。但是，PIF4在全基因组水平的热形态建成中的下游基因并未见报道。我们采用RNA-Seq的方法，得到了温和高温处理后受PIF4调控的269个下游基因（包括21个PIF4部分依赖的下游基因）。这些基因中生长素响应途径的基因（IAA6、IAA19、IAA34、SAUR22、SAUR57、SAUR59）和脱落酸响应途径的基因得到显著富集。此外，一些细胞壁伸长相关基因和逆境胁迫响应基因也得到富集。我们的结果为理解植物热形态建成的基因调控提供了帮助。

这些PIF4调控的热形态建成下游基因中，据估算大约有25%为热形态建成中PIF4调控的结合靶标基因，其他为PIF4间接调控的下游基因。例如，编码膜蛋白COR413IM1的基因AT1G29395被证明是PIF4的直接调控基因。温和高温处理下的该基因的诱导表达依赖于PIF4，野生型中组成性表达PIF4正常温度下该基因上调表达。而编码细胞壁成分、改变有关的木葡聚糖内糖基转移酶XTR7的基因AT4G14130并不被PIF4直接结合，是PIF4间接调控的下游基因。温和高温处理下该基因的诱导表达也依赖于PIF4，野生型中组成性表达PIF4正常温度下该基因也上调表达。

此外，PIF4对下游靶标基因的结合能力也有差别，当PIF4组成性表达后，有的靶标基因在正常温度下就可以被PIF4结合，而有些靶标基因只有在温和温度处理后才被PIF4结合。例如，编码磺基转移酶ATST2A的AT5G07010启动子只有在温和高温处理下才显著被PIF4结合。温和高温处理下该基因的诱导表达依赖于PIF4，野生型中组成性表达PIF4，正常温度下该基因没有上调表达，但温和高温处理后该基因明显诱导表达。这些结果暗示其他的温和高温处理依赖的转录调控因子可能与PIF4一起调控了该基因的表达。PIF4过表达植物正常条件下下胚轴伸长，温和高温下有进一步的伸长，而在检测的7个基因中，只有1个基因（ATST2A）的表达量在PIF4过表达植物中温和高温下有进一步上调表达，说明一部分PIF4调控基因在温和高温下对下胚轴的伸长非常重要。