翁思颖 王 磊 柴可夫#

1 浙江省宁波市中医院 浙江 宁波 315010 2 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的慢性微血管并发症，由此导致的终末期肾病已成为糖尿病患者死亡主因。研究发现糖尿病血管病变存在“代谢记忆”效应[1]。若前期血糖控制不佳，即使后期血糖控制良好，血管病变发生率仍高于长期血糖控制良好者[2]。而沉默信息调节因子1(Sirt1)可通过对腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性的调节，降低还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶水平、减少活性氧(ROS)积累、减轻高糖引起的氧化应激反应、减少肾损伤[3]。益气养阴活血汤是本团队基于对DN“气阴不足、阴虚耗津、炼津成瘀”的病机所形成的经验方。团队前期研究发现由该方所制的糖肾颗粒可改善DN大鼠肾脏内皮细胞功能、降低糖基化终末产物及其受体的表达[4-5]。故本研究拟通过建立人肾小管上皮细胞(HK-2)短暂高糖肾损伤模型，从Sirt1/AMPK通路途径探讨益气养阴活血汤缓解短暂高糖“代谢记忆”效应导致肾损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料：人肾小管上皮HK-2细胞株购于中国科学院典藏细胞库。低糖DMEM/F-12培养液(CORNING)、胎牛血清(Gibco)、青霉素/链霉素溶液(Gibco)、50%葡萄糖注射液(中南科伦)；小鼠单克隆抗SIRT1抗体(abcam)、兔单克隆抗AMPK-α2/phospho S491抗体(abcam)，兔单克隆抗AMPK-α2抗体(abcam)，兔单克隆抗p67phox抗体(abcam)，二抗山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗兔IgG抗体(中杉金桥)、抗GAPDH抗体(abcam,ab8245)；PVDF转印膜(Millipore)；紫外分光光度计(Beckman)，Mini-PROTEAN电泳系统，Mini Trans-Blot转印系统(Bio-Rad)，冻干机(CHRIST)。

1.2 实验药物制备：益气养阴活血汤冻干粉制备：生黄芪、女贞子、葛根各30g，丹参20g，制大黄5g。药材由浙江省中药研究所制剂室提供，药材粉碎后加5倍水煎煮1h，煎次，合并滤液后调整pH值至7，浓缩定容至生药含量2g/ml，微孔滤膜过滤除菌后，将药液加入8%甘露醇，置于冻干箱中，测定共熔点为-9℃，在冷冻机中-50℃预冻4h，并由-20℃低温干燥升华12h，32℃解析干燥8h后完成制备，4℃冷藏备用，使用时以对应培养基溶解至需要浓度，对照组细胞加入等量对应培养基。

1.3 细胞造模及实验分组：将HK-2细胞系接种于DMEM/F-12培养基(50/50Mix,5.6mmol/l葡萄糖)中，加入10%胎牛血清与1%青/链霉素，5%CO2、37℃、饱和湿度下培养。参照文献[6-7]方法，将第三代细胞以50mmol/L葡萄糖的高糖培养基(由5.6mmol/L葡萄糖培养基+50%葡萄糖注射液配置)干预16h，建立高糖损伤模型，设为高糖组(HG)；同时将正常HK-2细胞以低糖培养基(5.6mmol/L葡萄糖)培养16h，设立低糖组(LG)。将高糖培养16h的成模细胞更换低糖培养基，干预48h，建立短暂高糖组(HG+LG)；另以成模细胞更换低糖培养基，并加入益气养阴活血汤冻干粉干预48h，设立短暂高糖+TD组(HG+LG/TD)。

1.4 DCF法测定细胞内ROS水平：将种植于96孔板内的细胞去除培养基后，以无血清培养基稀释DCFH-DA至10μmol/L，每孔加入100μl含DCFH-DA培养基，37℃孵育30min后，去除含DCFH-DA培养基，以无血清培养基及PBS漂洗后，每孔加入PBS 200μl。激光共聚焦显微镜下观察ROS荧光强度，酶标仪以激发波长488nm，发射波长525nm测定荧光强度。

1.5 Western Blot法测定HK-2细胞Sirt1、NADPH氧化酶亚基p67phox蛋白表达量及AMPK-α2磷酸化程度：将细胞加入RIPA蛋白裂解液后提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度，行SDS-PAGE电泳分析，电泳(80V/20min，转120V/40min)后行蛋白质转膜(恒流，200Ma，105min)，结束后5%脱脂奶粉室温封闭1h。以封闭液1：1000稀释一抗后，4℃孵育过夜。二抗室温孵育1h。Image J软件分析光密度值，分别测Sirt1、AMPK-α2、pAMPK-α2、p67phox蛋白的表达。

1.6 统计学方法：采用SPSS20.0软件进行数据分析，计量资料以(mean±SD)表示，多组间比较采取单因素方差分析，若方差齐则采取L-S-D检验，方差不齐则采用Dunnett’T3检验；以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 短暂高糖对HK-2细胞ROS水平的影响及益气活血养阴汤干预作用：DCF法测各组细胞ROS水平。发现HG组、HG+LG组与LG组相比，ROS水平均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；HG+LG组与HG组相比，ROS水平无变化，差异无统计学意义(P＞0.05)；HG+LG/TD组与HG组相比，ROS水平下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。表明高糖可使HK-2细胞ROS水平升高，将高糖环境改为低糖环境不能使ROS水平改变，而在此基础上加用益气养阴活血汤则可降低ROS水平。见图1。

2.2 短暂高糖对HK-2细胞Sirt1、p67phox蛋白表达及AMPK-α2磷酸化程度的影响及益气活血养阴汤干预作用：Western blot法测各组HK-2细胞Sirt1、p67phox蛋白表达及AMPK-α2磷酸化程度。发现HG组、HG+LG组与LG组相比，Sirt1水平、pAMPK-α2/AMPK-α2比例均下降，p67phox水平均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；HG+LG组与HG组相比，Sirt1、pAMPK-α2/AMPK-α2、p67phox水平均无变化，差异无统计学意义(P＞0.05)；HG+LG/TD组与HG组相比，Sirt1、pAMPK-α2/AMPK-α2比例升高，p67phox水平均下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明高糖可下调HK-2细胞Sirt1蛋白表达、抑制AMPK-α2磷酸化程度减少其活性，以上调NADPH氧化酶亚基p67phox表达增加其活性；将高糖环境改为低糖后，这种改变将得以持续；而在改为低糖环境后同时加用益气化浊汤干预，则可上调Sirt1表达，升高AMPK-α2磷酸化水平、增强AMPK活性，进而下调p67phox、减少NADPH氧化酶活性。见图2。

图1 短暂高糖对HK-2细胞ROS水平的影响及益气活血养阴汤干预作用

图2 益气活血养阴汤对短暂高糖刺激后Sirt1、p67phox蛋白表达及AMPK-α2磷酸化程度的影响

3 讨论

研究表明，表观遗传改变是导致代谢记忆效应产生的重要原因之一。表观遗传相关酶Sirt1是一种NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶，可通过激活AMPK，增强AMPK对NADPH氧化酶的负调控，减轻氧化应激反应[3]。NADPH氧化酶是ROS生成的关键，研究发现DN患者肾组织中存在NADPH氧化酶的亚基表达水平增加，而降低NADPH氧化酶活性则可缓解氧化应激水平，进而缓解高糖引起的细胞损伤。

本团队基于糖尿病肾病“气阴不足、阴虚耗津、炼津成瘀”的病机理论，认为在中医学理论中“代谢记忆”效应产生的关键与“血瘀”有关。团队根据气阴不足为本，瘀血阻滞为标的病机，提出以益气养阴活血法治疗糖尿病肾病，自拟验方益气养阴活血汤，方中生黄芪益气扶正，葛根解热生津，女贞子养阴滋肾，丹参凉血活血，制大黄祛瘀通经，全方共奏益气养阴、活血通络之效[8]。

本研究发现，对短暂高糖刺激的细胞进以益气养阴活血汤进行干预，可使Sirt1表达、AMPK磷酸化升高，NADPH氧化酶活性及ROS水平降低。以上结果可表明，短暂高糖可能通过HK-2细胞内Sirt1/AMPK通路引发持续性氧化应激反应导致肾损伤“代谢记忆”效应，益气养阴活血汤可能通过Sirt1/AMPK通路的调控，改善短暂高糖经Sirt1对AMPK活性的持续性抑制，从而降低NADPH氧化酶活性与ROS水平，减轻氧化应激，缓解“代谢记忆”效应所引起的肾损伤。