梁嘉颖 郑毅春 李子涛 汪李虎 刘风华

广东省妇幼保健院生殖健康与不孕症科（广州510010）

准确的精液分析是诊断男性不育症的第一步，目前常用的标准是世界卫生组织2010年发布的《人类精液检查与处理实验室手册第5版》（简称WHO第5版）［1］，其中精子总数、前向运动（progressive motility，PR）精子百分率和正常形态精子百分率是评价精子质量的重要依据。根据中华医学会《临床诊疗指南辅助生殖技术与精子库分册》［2］，治疗轻、中度男性不育症首选的辅助生殖技术（ART）是宫腔内人工授精（intrauterine insemination，IUI），而合并女方不孕因素、重度少、弱、畸精子症及无精子症等，则可进行体外授精（in vitrofertilization，IVF）或卵泡浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治疗。但影响ART成功率的因素很多，包括女方因素、用药方案［3-4］、授精时机［5］、手术次数［6］、周期数［7］和男方精液因素［8-9］如优化处理后的活动精子总数。大量研究证实，优化处理后的活动精子数量不足会使ART的临床妊娠率降低［10］。但目前并未明确限定精液优化处理到授精的时间，且对延长该时间间隔与精子质量参数的相关性研究较少，而精子体外获能时间是与患者个体情况无关的变量，相对于其他影响因素，其可控性较强，因此，根据 WHO第5版［1］和前期研究结果［11］，本实验将精子体外获能时间分为20、40、80和120 min，主要目的是探讨优化处理后精液孵育至授精之间最佳的时间间隔，从而更有效地提高ART成功率。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象连续收集400例（正常精子、少精子症、弱精子症和畸形精子症各100例）于2017年1-12月在广东省妇幼保健院生殖健康与不孕症科就诊的男性受试者。诊断标准参照WHO第5版，精子总数≥39×106，前向运动（PR）精子百分率≥32%，正常形态精子百分率≥4%为正常精子；精子总数 ＜39×106为少精子症；PR%＜32%为弱精子症；正常形态精子百分率＜4%为畸形精子症［1］。所有受试者均签署知情同意书，研究经医院伦理委员会同意。

受试者年龄、精液体积、精子总数、浓度、总活力（progressive motility+non⁃progressive motility，PR+NP%）、PR%等数据组间差异见表1。

表1 优化处理前各组精液标本参数Tab.1 The baseline characteristics of prewash semen samples（n=100） ± s

表1 优化处理前各组精液标本参数Tab.1 The baseline characteristics of prewash semen samples（n=100） ± s

精液参数年龄（岁）精液体积（mL）精子总数（× 106）精子浓度（106/mL）PR%PR+NP%正常形态率（%）正常精子32.0±4.1 3.0±0.9 98.0±13.4 58.6±21.7 51.3±11.4 62.6±13.1 4.9±1.2少精子症31.4±3.9 1.8±0.9 46.8±10.7 17.6±7.1 60.8±12.4 76.8±11.9 5.2±1.1弱精子症31.7±2.8 2.6±0.9 92.5±14.0 46.2±19.1 25.5±5.3 51.6±10.5 5.0±0.8畸形精子症30.6±3.1 2.9±0.8 96.8±12.9 40.5±24.3 52.3±12.4 74.8±12.1 2.1±1.1 F值1.27 10.92 16.73 13.58 15.62 16.00 11.37 P值0.206 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

1.1.2 主要仪器与试剂西班牙Microptic公司SCA计算机辅助精液分析系统（CASA）；日本Olym⁃pus公司BX53普通光学显微镜；德国Eppendorf公司的移液器；上海齐欣科学仪器有限公司CU⁃600电热恒温水浴箱；珠海贝索生物技术有限公司精子（细胞）形态学快速染色液（Diff⁃Quik法）；瑞典Vitrolife公司SpermGrad梯度液、SpermRinse洗精液、IVF受精培养液等。

1.2 方法

1.2.1 精液采集受检者禁欲2～7 d，以手淫方式采集精液于洁净无菌的一次性采精杯中，随即放置37℃孵育箱20 min。记录精液采集时间、精液优化处理开始时间、精液优化处理后孵育开始时间。

1.2.2 精液常规检测按照WHO第5版［1］进行精液常规参数检验，记录精液体积，并采用CASA系统分析观察精子浓度、精子总数、PR+NP%和PR%。计算公式：精子总数=精液体积×精子浓度，PR精子总数=PR%×精子浓度×精液体积，活动精子总数=PR+NP%×精子浓度×精液体积。

1.2.3 精子形态分析采用Diff⁃Quik染色法［1］，普通光学显微镜下10×100倍油镜观察分析200条精子，计数顶体区异常、头部异常、颈部和中段异常以及尾部异常精子数，计算正常形态精子百分率。

1.2.4 精液优化处理采用密度梯度离心法，精液液化20 min后，制备1 mL＋1 mL 95%＋45%的SpermGrad梯度液分层，小心在最上层加入不超过1 mL精液。1 600 r/min离心20 min，吸管吸取最下层沉淀，在5 mL SpermRinse液中混匀，1 600 r/min离心5 min，弃上清，向沉淀中加入0.5 mL IVF培养液，混匀作为授精液，置5%CO2、37℃、95%湿度培养箱；根据WHO第5版［1］和前期研究结果［11］，将孵育时间设为20、40、80和120 min，记录每份精液优选后及孵育各时间点的PR+NP%、活动精子总数、PR%和PR精子总数。

1.3 统计学方法用SPSS 17.0软件进行统计分析，多个样本组比较采用重复测量方差分析，两两组间比较用q检验，率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常精子组精液优化处理后参数比较根据表2所示，正常精子组的PR+NP%和活动精子总数在孵育40 min最高，在120 min最低；PR%和PR精子总数在20 min最高，在120 min最低；采用多样本组间方差分析，PR%、PR精子总数、PR+NP%和活动精子总数在各时间点的差异有统计学意义（P＜0.001）。

表2 正常精子精液优化处理后孵育不同时间的精子参数Tab.2 Postwash semen parameters in different periods in group normozoospermia ±s

表2 正常精子精液优化处理后孵育不同时间的精子参数Tab.2 Postwash semen parameters in different periods in group normozoospermia ±s

注：与20 min比较，*P ＜0.01；与40 min比较，ΔP ＜0.01

精子参数精子浓度（106/mL）PR%PR精子总数（×106）PR+NP%活动精子总数（×106）0 min 30.3±19.5 92.9±6.2 10.1±5.1 98.0±5.0Δ 11.7±5.8Δ 20 min 30.2±19.5 96.3±5.8 12.3±5.3 98.3±3.7Δ 13.4±4.1Δ 40 min 30.1±19.5 93.8±9.1*9.2±3.6*98.6±2.7 14.4±2.6 80 min 30.3±19.5 90.3±12.2*8.8±2.6*97.4±4.6Δ 11.3±2.6Δ 120 min 30.4±19.6 87.5±10.5*8.1±1.7*93.4±8.3Δ 10.1±5.4Δ F值0.004 13.620 18.160 16.730 15.560 P值1.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 少精子症组精液优化处理后参数比较根据表3所示，少精子症组的PR%、PR精子总数、PR+NP%和活动精子总数在20 min最高，在120 min最低；采用多样本组间方差分析，PR%、PR精子总数、PR+NP%和活动精子总数在各时间点的差异有统计学意义（P＜0.001）。

表3 少精子症精液优化处理后孵育不同时间的精子参数Tab.3 Postwash semen parameters in different periods in group oligozoospermia ±s

表3 少精子症精液优化处理后孵育不同时间的精子参数Tab.3 Postwash semen parameters in different periods in group oligozoospermia ±s

注：与20 min比较，*P＜0.01

精子参数精子浓度（106/mL）PR%PR精子总数（×106）PR+NP%活动精子总数（×106）0 min 11.0±3.7 90.8±10.0 8.5±3.6 95.8±4.0 10.3±5.7 20 min 11.0±3.6 91.5±9.1 8.6±2.1 96.0±4.3 10.7±4.8 40 min 11.0±3.7 90.3±9.7*8.2±3.3*94.8±3.8*10.3±4.1*80 min 11.0±3.6 81.2±8.6*7.2±3.7*90.0±2.4*9.0±4.8*120 min 11.0±3.7 78.6±9.3*7.1±3.2*87.9±5.3*8.7±5.3*F值0.014 10.310 18.920 13.430 18.000 P值1.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 弱精子症组精液优化处理后参数比较根据表4所示，弱精子症组的PR%、PR精子总数、PR+NP%和活动精子总数在20 min最高，在120 min最低；采用多样本组间方差分析，PR%、PR精子总数、PR+NP%和活动精子总数在各时间点的差异有统计学意义（P=0.000）。

表4 弱精子症组精液优化处理后孵育不同时间的精子参数Tab.4 Postwash semen parameters in different periods in group asthenozoospermia±s

表4 弱精子症组精液优化处理后孵育不同时间的精子参数Tab.4 Postwash semen parameters in different periods in group asthenozoospermia±s

注：与20 min比较，*P＜0.01

精子参数精子浓度（106/mL）PR%PR精子总数（× 106）PR+NP%活动精子总数（×106）0 min 20.2±10.1 90.5±5.3 10.0±7.1 95.6±4.5 12.8±6.0 20 min 21.7±10.8 90.8±9.1 10.7±2.1 97.1±4.3 12.9±5.8 40 min 21.3±10.7 85.3±9.7*9.2±8.3*94.3±4.8*11.3±4.7*80 min 20.8±10.9 80.2±11.6*8.2±6.7*90.3±5.4*10.0±4.8*120 min 20.9±10.4 76.6±11.3*7.3±5.2*87.9±10.3*9.4±5.0*F值0.007 10.630 17.240 13.910 17.330 P值1.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 畸形精子症组精液优化处理后参数比较根据表5所示，畸形精子症组的精子总活力和活动精子总数在孵育40 min最高，在120 min最低，PR%和PR精子总数在20 min最高，在120 min最低；采用多样本组间方差分析，PR%、PR精子总数、PR+NP%和活动精子总数在各时间点的差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.5 正常精子组、少精子症组、弱精子症组和畸形精子症组各时间点精液参数的比较重复测量方差分析结果显示，优选20 min后，正常生育组、少精子症组、弱精子症组和畸形精子症组的各时间点精液参数差异均有显著性（表6）。

2.6 精子获能时间与IUI临床妊娠率的关系选择研究时间段内400例男性受试者中，妻子采用来曲唑（LE）促排方案进行IUI治疗的242个周期。根据获能时间的不同，分析了4组的临床妊娠率，分别为13.9%、25.9%、11.8%和0%，40 min组显著高于其他3组（均P＜0.05，表7）。

表5 畸形精子症组精液优化处理后孵育不同时间的精子参数Tab.5 Postwash semen parameters in different periods in group teratozoospermia ±s

表5 畸形精子症组精液优化处理后孵育不同时间的精子参数Tab.5 Postwash semen parameters in different periods in group teratozoospermia ±s

注：与20 min比较，*P ＜0.01；与40 min比较，ΔP＜0.01

精子参数精子浓度（106/mL）PR%PR精子总数（×106）PR+NP%活动精子总数（×106）0 min 30.5±14.3 92.3±2.4 13.2±6.3 97.0±1.1Δ 14.6±2.7Δ 20 min 30.7±13.8 93.4±5.1 14.0±7.1 97.1±1.3Δ 14.7±3.8Δ 40 min 30.3±12.1 92.7±4.5*13.2±6.3*98.3±2.8 15.3±4.1 80 min 30.1±10.9 84.2±1.6*11.2±6.7*92.3±6.4Δ 13.0±3.8Δ 120 min 30.0±12.4 78.6±1.3*10.1±7.2*87.9±10.9Δ 12.1±3.3Δ F值0.005 11.31 17.72 13.88 17.25 P值1.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表6 正常精子组、少精子症组、弱精子症组和畸形精子症组各时间点精液参数的比较Tab.6 Postwash semen parameters in different periods in all groups

表7 精子获能时间与宫腔内人工授精临床妊娠率的关系Tab.7 Correlation of clinical pregnancy with the incubation time from the end of semen processing to intrauterine insemination±s

表7 精子获能时间与宫腔内人工授精临床妊娠率的关系Tab.7 Correlation of clinical pregnancy with the incubation time from the end of semen processing to intrauterine insemination±s

注：与40 min比较，*P＜0.05

女方年龄（岁）男方年龄（岁）不孕年限（年）临床妊娠率［例/例（%）］20 min 30.7±1.8 33.4±5.1 3.0±0.1 10/72（13.9）*40 min 30.3±2.1 32.7±4.5 3.2±0.3 29/112（25.9）80 min 30.1±1.9 34.2±1.6 3.2±0.7 6/51（11.8）*120 min 30.0±1.4 33.6±1.3 3.1±0.2 0/7（0.0）*F/χ2值0.005 0.001 0.002 8.165 P值0.946 3.121 1.833 0.043

3 讨论

IUI是治疗轻度男性不育症的首选ART，IUI简单易行，费用低廉，不会引起严重的并发症，IVF主要用于治疗男方少、弱精子症及女方存在配子运送障碍或排卵障碍等不孕因素的患者，ICSI则是用于严重的少、弱、畸精子症或无精症患者的有效治疗方法［1-2］。正确的精液采集和优化处理是ART中非常重要的环节，不正确的精液采集可能因未收集到完整的精液而影响精子质量，还可能导致ART治疗失败等严重不良后果；根据WHO第5版［1］要求，精液标本应该在靠近实验室的私密房间采集，精液诊断性分析必须在采集后1 h内完成，因为标本的新鲜度会直接影响妊娠结局。精液离体后，精子的存活率和活动率会受体外温度和时间的变化影响而逐渐下降，新鲜精液标本中，精子可以在12 h内保持一定的前向运动率，并可存活24～48 h。

精液优化处理不仅可以去除精浆、不活动精子、畸形精子、细胞碎片和其他有害物质，还可制备含高比例的形态学正常的活动精子。因此，在进行各种ART治疗前，精液标本必须进行优化处理，以获得最佳功能精子。受精前，精子需孵育一定时间进行获能，获能后的精子运动活跃、顶体和精膜的流动性明显增加，具备发生顶体反应、精卵识别和融合的能力［12］，但孵育时间过长，培养液中的活动精子不断消耗葡萄糖、果糖等能量，使能量耗尽而无法在IUI手术或体外受精后到达准确的受精部位；男性睾丸精子中阻碍受精的DNA碎片亦会随获能时间的延长而增加［13］；精子在培养液中孵育时间越长，自发顶体反应率越高，进而影响卵子正常受精而降低临床妊娠率。本研究结果显示，弱精子症组精液在进行优化处理后，置5%CO2、37℃、95%湿度环境下孵育20 min，PR%、PR精子总数、PR+NP%和活动精子总数均为最高，而正常精子组、少精子症组和畸形精子症组的精子质量参数在孵育40 min内，不会因孵育时间的延长而下降，但当孵育时间达到80～120 min，4组相关参数均显著下降；每个时间点上4组比较结果为孵育20 min后，正常生育组、少精子症组、弱精子症组和畸形精子症组各精子质量参数均有显著性差异，提示弱精子症组精子质量可能更易受孵育时间影响。本研究还提示，获能时间在40 min的IUI临床妊娠率最高，与FAUQUE等［14］研究结果相似，该研究认为，优化处理后的精液在37℃孵育40～80 min能获得最适宜的IUI临床妊娠率。YAVAS等［15］则发现，精液采集后30 min内进行优化处理比31～60 min组妊娠率显著提高，精液采集后90 min内进行IUI比91～120 min组或＞120 min组妊娠率显著升高。各研究得出的具体孵育时间虽不尽相同，可能是由于采用了不同的精液优化处理技术或实验室检测技术［16］，但结果均显示，延长精液优化处理后至IUI手术或体外授精间隔时间，会对精子质量和临床妊娠率产生负影响。

综上所述，进行IUI治疗的精子获能时间应控制在40 min内，能显著改善患者的精子质量，因此各生殖中心实验室应根据不同病因患者选择适当的精液优化处理方法及精子体外获能条件。精子体外获能时间与ART临床妊娠结局的关系仍需进行更大样本，更全面的前瞻性随机对照研究进一步验证，才能得出更准确的结论。