曾小玲，黄建都，谢鑫鑫，祝金虹

（1.福州市蔬菜科学研究所，福建 福州 350111；2.武夷山市土肥技术站，福建 武夷山 354300）

萝卜（Raphanus sativusL.）又称莱菔，十字花科萝卜属，是我国最主要的根菜类蔬菜。采用杂种优势选育出综合性状优良的杂种一代是一种有效的育种手段。杂交育种通常是参照亲本性状的表现区别从而做出许多的组合配制，并且参照配合力而进行判断，组合比较试验可淘汰大部分的组合，选出少数优势强的组合，但常规育种方法受环境的影响大，人力物力耗费大，时间长，且效果很差。通过运用DNA分子标记亲本间遗传距离预测杂种优势的类似研究已经在玉米等多种作物[1-10]上进行，这将成为一种有效的育种手段之一。相关序列扩增多态性（SRAP）标记具有操作简单、多态性高、重复性好等[11]特点，在不同作物[12-14]遗传多样性分析中被应用，包括应用于萝卜的遗传多样性分析[15]、抽薹性状的分析[16]和种质资源指纹图谱分析[17]。本研究应用SRAP标记技术和萝卜产量性状[18]表型数据，通过解析萝卜亲本间遗传距离与杂交组合杂种优势的相关性，以寻找运用SRAP标记遗传距离预测萝卜杂种优势的可行性，为加快萝卜杂交种选育提供参考。

表1 供试材料及来源

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为福州市蔬菜科学研究所萝卜课题组育成的高代耐寒自交不亲和系11份，其中母本5份，分别是4-2H-4-1、13-2H-1、6-2H-2、24-1-8、20-9-3-5，父本6份，分别是39-3H-1、40-2H-2、18-2-2H-2、57-10-3-1H、9-3-1H、31-1H-1-3，具体见表1。按照NCⅡ不完全双列杂交设计，组配成1套包括11个亲本和30个F1的2个世代的材料。

1.2 田间试验设计

2015年10月中旬直播于长乐市石壁村试验地，包括11个亲本、30个组合、白龙春（CK）共42个材料，随机区组设计，3次重复，小区面积1.2 m×3.5 m，常规栽培管理。收获期，每小区随机取样10株进行考种，考查根长、株高、叶片数、外露长、叶片长、叶片质量6个农艺性状。

1.3 SRAP标记检测

1.3.1 基因组DNA的提取

采用CTAB提取法提取萝卜总DNA。取4片真叶时的萝卜嫩叶0.2 g，放入研钵中，加液氮迅速研磨成细末后，快速移入已经预热的含2×CTAB 600 μL、β-巯基乙醇5 μL提取缓冲液的1.5 mL离心管中，充分混匀，65 ℃温浴15 min；常温下12 000 r/min离心10 min；取上清600 μL，加入等体积的酚︰氯仿︰异戊醇混匀，4 ℃、12 000 r/min离心5 min；取上清，加入2倍体积无水乙醇，-20 ℃静置30 min；4 ℃、12 000 r/min离心10 min析出DNA沉淀，去上清；用70%乙醇，将DNA悬浮洗涤；4 ℃、8 000 r/min离心5 min，弃上清，吹干后将DNA溶解于ddH2O中，置于-20 ℃保存。

1.3.2 SRAP的PCR扩增与检测

SRAP引物参照Zhang等[19]的报道，由生工生物（上海）股份有限公司合成。其中的1 3条正向引物以及1 6条反向引物依次为：me1～me13/em1～em16，2种不同的引物共组合成208个引物对。SRAP-PCR扩增体系为20 μL：30 ng模板DNA，2 μL的10×Buffer，0.4 μL的10 mmol/L dNTP，5 μmol/L的正反向引物各1 μL，0.2 μL的Taq，补水至20 μL。扩增程序参照缪体云等[20]的方法并稍作修改：94 ℃预变性3.5 min；94 ℃变性30 s，35 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，5个循环；94 ℃变性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR的扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为1×TAE。

1.4 数据分析

1.4.1 亲本间分子遗传距离

根据PCR扩增产物的电泳结果，在电泳图谱上将同一引物对、同一位点有DNA扩增带记为1，同一位置上无带记为0，形成0，1矩阵。

通过NTSYS 2.1统计分析软件计算任意2个材料间的遗传相似系数（GS）与遗传距离（GD），计算公式为GS=2Nab/（Na+Nb），GD=1－GS；公式中，Nab代表材料a与b共有的扩增条带总数，Na、Nb依次代表材料a和b中显示的扩增条带数量。

1.4.2 杂种优势

用常规考种方法，测定田间亲本与杂种一代的根长、株高、叶片数、展开度、叶片长、根粗等农艺性状，从而计算出杂种优势。杂种优势计算方法为：中亲优势=（F值－双亲平均值）/双亲平均值×100%；高亲优势=（F值－高亲值）/高亲值×100%；公式中，F值代表主要产量相关农艺性状平均值，即将每个组合的优势累加和除总组合数；双亲平均值代表双亲同一性状平均值；高亲值代表高值亲本同一性状平均值。将双亲SRAP标记分子遗传距离与F值、中亲优势和高亲优势值进行相关分析，用分子标记遗传距离预测F1的产量性状表现以及杂种优势的强弱。以上试验结果的计算与分析在DPS 7.05与Excel软件上进行。

2 结果与分析

2.1 萝卜主要农艺性状的遗传变异

通过对11个亲本中的6个产量相关性状进行遗传变异分析（表2），其中供试亲本6个农艺性状的F值（平均值）均达到了极显著水平，这说明供试的11个亲本在6个农艺性状上彼此间都存在极显著的遗传差异。通过变异系数大小又不难发现，供试亲本间叶片长度与叶片质量的变异最明显，变异系数分别为0.31与0.34；而株高的变异最小，变异系数为0.16。表明多数形态性状上存在显著或极显著差异。

2.2 SRAP分子标记多态性比较

选择208对SRAP引物组合分别对11个亲本进行PCR扩增，结果从中分别筛选出亲本间含多态性的SRAP引物共53对。53对SRAP多态性引物一共扩增出896条清晰条带，然而每对引物组合产生5～29条扩增带，平均有14.2条，呈现出多态性的谱带数目共有327条，该数量占总条带数的36.5%；其中，每1对引物组合都产生1～15条多态性带，平均为5.2条，相当于平均检测到5.2个等位基因。

2.3 SRAP标记估算的亲本间遗传距离比较

通过观察SRAP标记结果，分别估算11个亲本间的遗传距离GD（表3）。其中，SRAP标记显示的供试亲本间遗传距离变异范围为0.162～0.486，其中57-10-3-1H与13-2H-1之间的遗传距离最远，为0.486，表明这2个材料亲缘关系较远；而4-2H-4-1、40-2H-2和18-2-2H-2这三者两两之间的遗传距离最近，均为0.162，表明这3个材料间亲缘关系较近；参试亲本间的平均遗传距离为0.291，表明供试亲本之间遗传基础狭窄，遗传差异不明显，亲缘关系较近，组配出强优势组合的概率较低。

2.4 F1农艺性状杂种优势表现

通过计算F1主要农艺性状的中亲优势和高亲优势的变幅和平均值可获知（表4），叶片数的中亲优势最大，30个组合的中亲优势的平均值为12.11%，变幅为－10.57%～39.27%，中亲优势表现为正向优势的组合数占50.00%；高亲优势平均值为1.91%，变幅为－21.57%～26.27%，高亲优势表现为正向优势的组合数占33.33%。其次，中亲优势较大的性状是株高、外露长和根长，其30个组合的中亲优势平均值分别是10.76%、8.17%和8.03%，变幅分别是－11.26%～49.24%、－7.48%～28.16%和－20.68%～40.56%，中亲优势表现为正向优势的组合数分别占60.00%、60.00%和53.33%；高亲优势平均值分别为3.50%、－2.55%和0.76%，变幅分别是－21.45%～30.21%、－15.89%～13.25%和－33.25%～31.24%，高亲优势表现正向优势的组合数分别占43.33%、40.00%和43.33%，株高的高亲优势最大。叶片长与叶片质量的杂种优势都较小，其30个组合的中亲优势平均值分别为3.68%与1.61%，变幅分别为－4.61%～17.38%和－2.03%～18.58%，中亲优势表现为正向优势的组合数分别占63.33%和43.33%；高亲优势平均值分别为－2.65%和－1.95%，变幅分别为－11.74%～5.34%和－9.88%～10.87%，高亲优势表现为正向优势的组合数分别占36.67%和30.00%。综合中亲优势和高亲优势结果来看，株高的杂种优势最大，其次是叶片数和根长，说明在萝卜亲本的筛选中应优先考虑的指标是株高，其次是叶片数和根长指标。

表2 亲本主要农艺性状遗传变异

表3 11个亲本间的SRAP标记遗传距离（GD）

表4 F1主要产量相关性状杂种优势

表5 SRAP标记估算的遗传距离和F1杂种优势的相关系数

2.5 SRAP标记估算的遗传距离与农艺性状杂种优势的关系

将双亲分子遗传距离、Fl杂种表现和农艺性状杂种优势间的相关性进行分析（表5），分子遗传距离与F1杂种表现的相关分析表明：分子遗传距离与株高之间达显著正相关，相关系数r=0.41，与其他5个农艺性状的相关系数都不显著。分子遗传距离与各农艺性状的中亲优势相关分析表明：分子遗传距离与株高、根长和叶片数间达显著正相关，相关系数r分别为0.44、0.44、0.41，与外露长、叶片长和叶片质量间相关系数均不显著。与各农艺性状的高亲优势相关分析表明：分子遗传距离与株高间达极显著正相关，相关系数r=0.48，与根长和叶片数间均达显著正相关，相关系数r分别为0.43和0.38，分子遗传距离与外露长、叶片长和叶片质量间相关系数均不显著。

3 讨论

3.1 萝卜主要农艺性状的杂种优势

利用SRAP分子标记进行萝卜遗传多样性的分析已有报道，周娜[16]通过UPGMA聚类分析，将32份萝卜分为4大类，和传统的系谱分类一致。刘哲等[17]运用群体分离分析法从而筛选出SRAP引物组合，扩增出了和晚抽薹萝卜基因紧密连锁的多态性片段LB，从而成功做到了分子标记辅助育种，并且通过这种方式降低了萝卜选育过程中对表型性状的依赖，大大提升了萝卜育种的效率。本试验结果和前人的研究结果都证明，运用SRAP分子标记技术可有效地分析萝卜材料的遗传多样性，实现快速划分与利用杂种优势群。F1不同产量相关性状的中亲优势变幅为1.61%～12.11%，高亲优势变幅为－2.65%～3.50%，说明了因为农艺性状与杂交组合的不同，萝卜的农艺性状杂种优势大小有很大的差别，其中，既存在表现杂种优势大的性状与组合，也存在表现小的性状与组合。

3.2 SRAP分子标记预测杂种优势的可能性

遗传距离是衡量品种间多个性状综合遗传差异大小的指标，植物育种实践已经检验并且承认了其客观性，双亲的基因型差异越大，杂种优势越强[21]。由于DNA分子标记技术的不断发展，越来越多的研究者尝试使用许多不同的分子标记技术对不同作物的遗传距离和杂种优势之间的相关性进行研究，并且获得了不同的结论。Lee等[22]和Smith等[23]研究表明，分子标记遗传距离和杂种优势之间呈现出极显著正相关；而廖伏明等[24]和张涛等[25]的研究却表明分子标记遗传距离与F1杂种优势之间并没有明显的相关性，不能将其用于杂种优势的预测。

本研究结果表明，6个主要农艺相关性状杂种优势中株高的中亲优势较大，高亲优势最大，其次是叶片数、根长；在相同的SRAP标记的遗传距离和杂种优势的相关系数中，遗传距离和株高的F1杂种的表现、中亲优势和高亲优势的相关系数都呈显著相关或极显著相关水平，遗传距离与叶片数、根长的中亲优势和高亲优势的相关系数都呈显著相关水平；说明在萝卜亲本的筛选中应先考虑株高，其次是叶片数、根长，这样才有可能在高密度直播种植模式下组配出杂种优势强的产量相关性状的组合而实现高产。另一方面，SRAP标记的遗传距离与F1杂种表现既有显著相关，也有不显著相关；与各主要农艺性状杂种优势相关达到极显著、显著相关或不显著相关水平，显著或极显著相关系数介于0.38～0.48，表明SRAP分子标记遗传距离在一定程度上能反映出农艺性状杂种优势的强弱，但是其相关程度还不能够准确地预测杂种优势。

通过试验发现，SRAP遗传距离和农艺性状杂种优势与F1杂种表现的关系比较复杂。SRAP分子标记遗传距离虽然能反映材料间的遗传差异，但是SRAP分子标记是覆盖在整个基因组上的，其双亲间的遗传距离是亲本全部位点上的差异，这涉及了大量和研究目标性状无关的位点，使用它来分析分子遗传距离和杂种优势的相关性时将存在误差；然而，通过运用与杂种优势相关的QTL连锁的标记位点来分析亲本间的遗传差异与杂种优势的相关性则更加具有准确性。张涛等[6]通过运用和产量性状相关的功能基因标记分析了杂交水稻组合亲本间的遗传差异，从而研究了标记遗传距离和产量杂种优势的相关性，结果表明两者呈现显著正相关，这可以证明功能基因标记可以运用于杂交水稻杂种优势预测，但最终结果将依赖于杂种优势遗传机理的阐明。