姜云晶，杨子鹏，朱电锋，范梦雪，陈晓芳，储小燕，张娅菲，刘 秦，刘锦芳，李 玉，冯士彬，吴金节，王希春

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥230036)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是由某些真菌产生的一种霉菌毒素，世界范围内均有检出，主要污染玉米、大麦、小麦等农产品及其制品。DON污染后，农产品的生物活性及其营养价值均被破坏，质量水平大幅降低[1-2]。DON虽然毒性较低，但其检出率较高，因此动物DON中毒的发病率一直居高不下。DON的毒性作用主要是影响动物的神经系统、免疫系统及胃肠道[3]，各类动物误食DON后会表现出不同程度的症状，其中猪在所有动物中的表现最为严重[4]。国内外研究人员已着力于探索DON的神经毒性分子机制，并且在此领域获得了初步成果。耿芳芳等[5-7]研究指出，DON对雏鸡具有一定的神经毒性作用，可引起雏鸡生长缓慢、便血、脂质过氧化反应及大脑海马组织超微结构发生明显变化，脑中Ca2+与钙调蛋白(CAM)含量及其mRNA相对表达量显著降低。Prelusky等[8]发现，DON可以快速通过血脑屏障进入大脑，并达到峰值。DON还能够在脑部不同部位引起某些神经递质的变化[9]，导致免疫应答迟滞、脑中 5-HT含量升高，进而导致动物行为异常，出现食欲不振、肢体运动障碍、呕吐以及嗜睡症状。Swamy等[10]用含DON的日粮饲养断乳小猪，结果发现仔猪出现摄食量下降、生长迟缓、脑桥NE水平降低、脑部个别部位5-羟吲哚乙酸含量变化等现象。可见，DON引起的生长抑制、呕吐、食欲减退等都可能与神经内分泌紊乱及神经损伤有关。

自噬是细胞损伤后做出的自主性防御行为，通过胞内囊泡的形式包裹受损的细胞器以及某些有害的大分子物质并将其运送至溶酶体，随后溶酶体内的酶系统将其溶解，从而实现细胞自身的代谢和受损细胞器的更新。根据清理细胞内有害物质的途径不同可将自噬分为3种：大自噬、小自噬以及依赖分子伴侣产生的自噬，其中大自噬最为常见，也是人们常称的自噬。目前，对于DON神经损伤的研究主要集中在神经细胞凋亡和组织坏死方面，而关于DON引起的神经毒性中是否有自噬的参与以及自噬的作用，国内外尚未见相关文献报道。PC12细胞是来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞株，与神经内分泌细胞的特征相似，被视为神经细胞试验的良好模型[11]，其传代稳定，常用于神经生理、病理以及药理学科学研究领域。本研究以PC12细胞为对象，通过体外试验研究了不同质量浓度DON对PC12细胞自噬(大自噬)的影响，以期为自噬在DON诱导神经细胞损伤中的作用研究提供试验依据，并丰富和完善DON神经毒性的基础理论。

1 材料与方法

1.1 材 料

PC12细胞，南京凯基生物科技发展有限公司；DON，Sigma公司；β-actin小鼠单克隆抗体，北京锐抗生物科技有限公司；class Ⅲ PI3K抗体，北京博奥森生物技术有限公司；Beclin-1抗体和LC3抗体，美国SANTA公司；P62抗体，沈阳万类生物科技有限公司；Trizol RNA提取试剂盒，大连宝生物工程有限公司。

Bestar®SybrGreen qPCR Mastermix，德国DBI公司；StarScript Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Mix，GenStar公司；荧光定量PCR仪，美国Thermo 公司；TEOL-2010电子透射显微镜，日本电子株式会社。

1.2 PC12细胞的培养与DON处理

将1 mg的 DON用无菌水配制成1 mg/mL DON基础工作液，将其加入到DMEM高糖培养基中，配制DON质量浓度分别为125，250，500，1 000 和2 000 ng/mL的工作液。于正方透气盖斜口细胞培养瓶内用DMEM高糖培养基(添加体积分数10% 的FBS和适量的抗生素)培养PC12细胞，培养条件为37 ℃、体积分数5% CO2。将生长状态良好的PC12细胞用DMEM高糖培养基调节细胞密度为5×105mL-1，接种于六孔板内连续培养24 h，然后用配制好的不同质量浓度的DON处理细胞24 h，收集处理后的细胞，用于细胞生长状况、形态、超微结构和自噬泡的观测，以及自噬相关基因Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(class Ⅲ PI3K)、人抑癌基因蛋白Beclin-1、哺乳动物真核细胞胞质内调控蛋白(P62)的mRNA表达水平和微管相关蛋白1轻链3 (LC3Ⅱ)、P62、class Ⅲ PI3K蛋白表达水平的测定。

1.3 DON对PC12细胞形态和超微结构的影响

取1.2节经不同质量浓度DON处理的PC12细胞，在倒置显微镜下观察细胞生长状况及形态变化，然后用戊二醛固定细胞后制作电镜切片，观察细胞超微结构的变化。

1.4 DON对PC12细胞自噬的影响

调整PC12细胞密度为2×105mL-1，备用。将圆形细胞爬片铺入24孔板内，每孔接种0.5 mL上述PC12细胞，培养24 h，之后分别加0(对照组(CK))，125，250，500，1 000和2 000 ng/mL的DON工作液0.5 mL/孔，培养24 h，弃工作液，取细胞爬片备用。细胞爬片用PBS清洗后用体积分数4%多聚甲酸固定30 min，体积分数0.5% TritonX-100室温透膜20 min，添加50 g/L BSA封闭液，置室温条件下20 min，LC3一抗4 ℃孵育过夜，PBS清洗2次(5 min/次)，加入Cy3标记的二抗在室温条件下避光反应1 h，清洗二抗，100 ng/mL DAPI染色10 min，PBS清洗，封片观测LC3聚点率。

1.5 DON对PC12细胞class Ⅲ PI3K、Beclin-1、P62基因 mRNA表达水平的影响

根据GenBank中的class ⅢPI3K、Beclin-1、P62和Actb(内参)基因序列(GenBank登录号分别为：NC_005105.4、NC_005109.4、NC_005104.4和NC_005111.4)，用Primer3软件设计引物(表1)。引物由华大基因公司合成。

表1 class Ⅲ PI3K、Beclin-1、P62和Actb基因的引物信息Table 1 Primer pairs for class Ⅲ PI3K,Beclin-1,P62 and Actb genes

取1.2节经不同质量浓度DON处理的PC12细胞，用Trizol 法提取RNA，测定RNA浓度。RNA使用StarScript Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Mix在42 ℃进行反转录30 min，85 ℃ 5 min使反转录酶失活，获得所需cDNA。

参照StepOneTMReal-time PCR System和Bestar®SybrGreen qPCR Mastermix配制PCR反应体系，然后按以下程序进行PCR扩增：95 ℃预变性 2 min； 95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环；72 ℃延伸5 min。熔解曲线95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min， 按照每10 s 0.5 ℃的速度由55 ℃升温至98 ℃。各试验组的class ⅢPI3K、Beclin-1、P62基因和内参基因Actb均在同一参数下进行3次重复性试验。以0 ng/mL DON处理的PC12细胞为内参(设定其表达水平为1)，采用2-ΔΔCt方法[12]计算其他处理PC12细胞class ⅢPI3K、Beclin-1、P62基因的相对表达量。

1.6 DON对PC12细胞自噬相关蛋白表达的影响

以β-actin蛋白为内参，采用Western-blot法分析DON对自噬相关蛋白表达水平的影响。取1.2节经不同质量浓度DON处理的PC12细胞，按照碧云天公司提供的试剂盒抽提总蛋白，用于LC3Ⅱ、P62、class Ⅲ PI3K蛋白表达水平的检测。采用BCA工作液测定各试验组提取物的总蛋白含量，调节总蛋白含量使其一致。将上述总蛋白样品加入5×SDS loading buffer，95 ℃水浴热处理10 min后-80 ℃保存备用。总蛋白以50 μg 的上样量进行SDS-PAGE电泳(50 g/L浓缩胶，class Ⅲ PI3K、p62使用120 g/L分离胶， LC3使用150 g/L分离胶)，试验条件为：120 V电泳20～30 min，当待检样品到达分离胶边界后把电压降为80 V，继续电泳60～80 min。随后依照负极-海绵-靠胶滤纸-胶-PVDF膜-靠膜滤纸-海绵-正极的次序放入电泳槽，120 V电压下转膜40 min，转膜完成后，将其置于50 g/L BSA溶液中，在摇床上室温匀速震动封闭4 h。加class Ⅲ PI3K(1∶250)、 P62(1∶500)、LC3 (1∶750) 一抗，冷藏条件下过夜孵育；加二抗(1∶10 000) 室温孵育2 h。进行ECL化学发光检测，暗室曝光显影，凝胶成像处理系统拍照后，用软件对所获得的图片进行灰度扫描分析。

1.7 数据分析

2 结果与分析

2.1 DON对PC12细胞形态的影响

分别用配制好的不同质量浓度的DON处理PC12细胞24 h后，观察细胞的生长情况，结果表明，对照组(0 ng/mL DON)PC12细胞饱满，细胞充满整个视野，紧密地连接在一起，甚至出现接触抑制现象(图1-A)；随着DON质量浓度的增大，PC12细胞之间空隙逐渐变大，凸起结构逐渐变少，正常细胞的饱满伸展形态丧失，体积缩小渐为圆形，视野内漂浮和贴壁不紧的细胞增多(图1-B～F)。

A～F分别为0 (CK)，125，250，500，1 000和2 000 ng/mL DON处理的细胞
A-F represent 0 (CK),125,250,500,1 000 and 2 000 ng/mL DON treated cells,respectively
图1 DON对PC12细胞生长状态的影响(×400)
Fig.1 Effect of DON on PC12 cell growth state (×400)

2.2 DON对PC12细胞超微结构的影响

PC12细胞经过DON暴露，制片后使用透射电镜观察其超微结构，结果见图2。图2表明，对照组细胞胞质均匀；DON处理组细胞胞质中有空泡，出现了双层或多层膜包裹的自噬小体和晚期自噬溶酶体结构，且DON质量浓度越高，PC12细胞的空泡化越明显，2 000 ng/mL DON组出现的胞质空泡化细胞最多，部分视野可见自噬小体。

2.3 DON对PC12细胞自噬的影响

由图3可见，对照组细胞呈微弱红色荧光且LC3未见点状聚集现象；不同质量浓度的DON均可引起LC3发生聚点现象，且随着DON质量浓度的增加，LC3呈点状在细胞核周边凝集的数量呈先增加后减少的趋势，当DON质量浓度为1 000 ng/mL时发生 LC3聚集的细胞数量最多。计算各处理的聚点率，结果(图4)发现，500，1 000和2 000 ng/mL DON处理PC12细胞的聚点率极显著高于对照组(P<0.01)，表明DON暴露可诱导PC12细胞发生自噬现象。

Ⅰ.Cy3标记LC3结果，Ⅱ.DAPI染色结果，Ⅲ.Merge结果。箭头标示发生聚点的LC3
Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ show the results of Cy3 mark LC3, DAPI staining and Merge,respectively.Arrows point the presence of LC3 puncta
图3 不同质量浓度 DON对PC12细胞自噬的影响
Fig.3 Effect of DON on autophagy of PC12 cell

*，**分别表示与对照组(0 ng/mL DON)相比差异达显著(P<0.05)和极显著(P<0.01) 水平。下图同
* and ** represent significant difference (P<0.05) and highly significant difference (P<0.01) compared with control group,respectively.The same below
图4 DON对PC12细胞聚点率的影响
Fig.4 Effect of DON on punctuate ratio of PC12 cell

2.4 DON对PC12细胞自噬相关基因mRNA表达的影响

采用RT-PCR方法检测class ⅢPI3K、Beclin-1、P62 mRNA的相对表达水平，结果见图5。由图5可知，试验组class ⅢPI3KmRNA相对表达水平均极显著高于对照组(P<0.01)，且当DON质量浓度为125～1 000 ng/mL时，class ⅢPI3KmRNA相对表达水平逐渐增高，在DON质量浓度为1 000 ng/mL时达到峰值，之后表达水平下降。Beclin-1 mRNA相对表达水平在经DON刺激后极显著增加(P<0.01)，在DON质量浓度为1 000 ng/mL时达到最大值。P62 mRNA相对表达水平随着DON质量浓度的增加而显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)下降，在 DON质量浓度为1 000 ng/mL时降至最低。

2.5 DON对PC12细胞自噬相关蛋白表达的影响

DON对PC12细胞自噬相关蛋白表达影响的SDS-PAGE电泳检测结果见图6。由图6可知，不同质量浓度DON对LC3Ⅱ、P62和class Ⅲ PI3K蛋白表达的影响有差异。

由图7可知， DON处理组PC12细胞LC3Ⅱ蛋白的表达量随DON质量浓度的增大而呈先增加后降低的趋势，1 000 ng/mL DON处理组表达量最高；与对照组相比，250～2 000 ng/mL DON处理组LC3表达量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)增加。与对照组相比，DON处理组PC12细胞P62蛋白表达量均极显著降低(P<0.01)，其中以1 000 ng/mL DON 处理组最低。DON处理组PC12细胞class Ⅲ PI3K蛋白的表达量随DON质量浓度的增大而呈先增加后降低的趋势，以1 000 ng/mL DON处理组表达量最高；与对照组相比，500～2 000 ng/mL DON处理组细胞class Ⅲ PI3K蛋白表达量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)增加。

图5 DON 对PC12细胞自噬相关基因mRNA表达的影响
Fig.5 Effects of DON on autophagy-related genes expressions of PC12 cells

图6 DON对PC12细胞自噬相关蛋白表达影响的SDS-PAGE电泳检测
Fig.6 SDS-PAGE results of effect of DON on autophagy-related proteins

图7 DON对PC12细胞自噬相关蛋白表达水平的影响
Fig.7 Effect of DON on autophagy-related proteins

3 讨 论

国内外关于DON的研究一致指出，DON对动物造成的各种损害最终都是通过细胞凋亡和坏死实现的，体外试验发现，DON暴露能够引起各类细胞的凋亡和坏死，但在DON造成细胞坏死和凋亡的过程中是否存在自噬的参与至今鲜有研究。而自噬与凋亡、坏死类似，在神经细胞功能发挥方面起重要作用。因此，本研究选用有类似神经细胞功能的PC12细胞为对象，通过电镜、免疫荧光、qRT-PCR法及Western-blot等试验技术研究DON处理后PC12细胞是否发生自噬以及发生自噬的分子机制。自噬小体以及自噬溶酶体是评价自噬发生的重要指标[13]。本试验使用透射电镜观察DON处理后的细胞，大部分视野可见自噬小体以及自噬溶酶体。

LC3在细胞内由泛素样蛋白合成，经Atg4同源物催化后其暴露出某些氨基酸残基，形成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ溶于整个细胞浆内。当细胞发生自噬时，LC3Ⅰ与囊泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)特异性结合，最终形成能够直观反映自噬的LC3Ⅱ。在自噬发生的最后一个阶段——自噬溶酶体的形成阶段，LC3Ⅱ会被溶酶体内的一系列酶降解。LC3Ⅱ的含量能够直观地反映自噬泡的数量，二者呈正相关关系。酸性自噬泡的形成是自噬的一个重要特征[14-15]。因此，可采用检测LC3Ⅱ的含量来评判自噬发生的强弱[16-18]。Han等[19]在DON诱导的猪卵母细胞发生自噬和凋亡的试验中指出，自噬泡较多组的LC3含量也较多。本研究发现，高剂量DON可以使自噬泡的形成增多，免疫荧光及Western-blot检测LC3Ⅱ含量也较多，这与Tang等[20]的研究结果一致。

PI3K是自噬过程中重要的调节蛋白之一。依据其结构可将PI3K分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3类，在最早的研究中发现在添加Class Ⅲ PI3K的抑制剂后自噬的程度减弱，这反向证明了class Ⅲ PI3K能够促进自噬的发生。PI3K的Ⅰ型和Ⅱ型最丰富，Ⅰ型PI3K及其产物通过激活Akt/PKB，进而活化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制自噬[21]。只有Ⅲ型PI3K(class Ⅲ PI3K)才是自噬的正调控蛋白，通过与Beclin-1结合共同致力于自噬泡的核化过程[22-24]。本研究在基因和蛋白表达水平上测定的class Ⅲ PI3K表达量都符合该蛋白在自噬中的表达方式。

如今，针对Beclin-1在自噬领域内的研究越来越广泛。类似的研究报道有，当Beclin-1基因的表达水平增高时，人类乳腺癌细胞中自噬小体的数量上升，但细胞增殖受到抑制[25]。也有体外研究发现，Beclin-1基因表达量降低时，机体细胞的增殖机能上升，自噬水平逐渐下降[26]。Beclin-1基因编码序列相仿于酵母Atg6，Beclin-1蛋白不具酶活力，是影响自噬活性的重要因素，主要与各蛋白之间的调节因子接触辅助调控Vps-34，最终与Vps34-Vps15结合作用于自噬溶酶体，促进自噬的发生。本试验结果表明，DON处理后PC12细胞Beclin-1的基因表达水平提高，与自噬程度的变化趋势一致。

P62具有细胞因子调控、信号转导、蛋白更新以及自噬调节等功能。P62中有一个称为LIR的线性结构域，该结构域能够与自噬标志物LC3相互结合并与泛素化蛋白相连，参与自噬的过程，最终将受损的细胞器、有害大分子以及异物运送至溶酶体形成自噬溶酶体而将其溶解。研究发现，在自噬缺陷性试验中检测到了P62蛋白含量大量增多，进一步揭示了P62蛋白与自噬存在密不可分的关系[27]。自噬过程中伴随着P62蛋白被自噬溶酶体水解这一过程，因此P62蛋白的含量与自噬强度呈负相关关系[28]，这与本试验P62蛋白表达水平随着DON质量浓度的升高而下降的结果一致。

综上所述，DON能促使PC12细胞的生长状态发生改变，造成细胞破损，并显著调节自噬相关基因mRNA与蛋白的表达水平，诱导PC12细胞发生自噬。