赵小琪，黄英，杨明华，潘洪彬，赵素梅



真核表达载体pIRES2-AcGFP1-PLIN2的构建及其在3T3-L1前脂肪细胞中的表达

赵小琪，黄英，杨明华，潘洪彬，赵素梅通信作者

（云南农业大学 动物营养与饲料重点实验室，昆明 650201）

构建pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表达载体，并观察其在3T3-L1前脂肪细胞中的转染状况。采用分子克隆技术，将PLIN2基因连接到pMD18-T载体中做Ⅰ/I双酶切，将酶切产物回收并将双酶切后的目的片段与pIRES2-AcGFP1载体连接，转入DH5α感受态细胞，并提取pIRES2-AcGFP1-PLIN2阳性重组质粒，转染到3T3-L1前脂肪细胞，显微镜观察转染情况。本研究成功克隆出了PLIN2基因，同时成功构建了pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表达载体，并在3T3-L1前脂肪细胞中成功表达，于显微镜下观察到绿色荧光，试验为进一步研究PLIN2基因对脂肪细胞的调控机理奠定了基础。

乌金猪；PLIN2基因；真核表达载体

脂滴相关蛋白存在于脂滴表面，这些蛋白调节着脂滴中脂肪的合成与分解代谢。其中，PAT 家族是最重要的脂滴相关蛋白，脂肪分化相关蛋白（perilipin 2，PLIN2）属于PAT家族成员之一[1]。研究发现，PLIN2基因可促进脂滴的形成，同时能通过阻碍脂肪细胞甘油三酯水解酶（ATGL）与脂滴表面接触实现屏障功能[2]。猪是研究脂肪代谢最佳的模式动物之一，构建猪PLIN2基因的真核表达载体对研究脂肪细胞内脂类代谢机制具有重要作用。

本研究通过分子克隆技术，克隆了乌金猪PLIN2基因，成功构建了pIRES2-AcGFP1- PLIN2真核表达载体，并在3T3-L1前脂肪细胞中成功表达，为进一步研究PLIN2基因对脂肪细胞的调控机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择健康、胎次相近、体重达100 kg的乌金猪6头，公母各半，屠宰，取背最长肌相同部位的肌肉于-80 ℃保存备用。反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；TRIzol总RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；限制性内切酶、pMD18-T Vector、DH5α感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司；3T3-L1前脂肪细胞由中国农业大学实验室惠赠；pIRES2- AcGFP1表达载体由云南农业大学版纳微型猪实验室馈赠。

1.2 总RNA的提取

猪背最长肌中总RNA的提取采用TRIzol法。同时，用紫外-可见分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和纯度。

1.3 PCR引物设计

参考GenBank中猪的PLIN2基因序列，采用DNASTAR软件进行比对，然后使用Primer Premier 5.0软件设计引物，上、下游引物分别加入I和I酶切位点和保护碱，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

表1 目的基因的引物序列、产物长度及登录号

1.4 PLIN2基因的克隆和鉴定

取2 µg总RNA进行反转录，反应体系（总体积为20 μL）：0.5 mmol/L dNTP 2 µL，12 µmol/L随机引物2 µL，10 U反转录酶（M-MLV RTase）1 µL，20 U RNA酶抑制剂（RNase inhibitor）0.5 µL，5 ×RT Buffer（含250 mmol/L Tris-HCl pH值8.3，50 mmol/L DTT，250 mmol/L KCl，50 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L Spermidine）4 µL，RNase-free Water加至20 µL。先加RNA模板，随机引物和dNTP，70 ℃变性5 min，立即置于冰上冷却，然后加其余试剂，37 ℃反应60 min，95 ℃灭活5 min。反转录的cDNA -20 ℃保存，备用。

用胶回收试剂盒回收目的片段，连接到pMD18-T载体上，转入DH5α感受态细胞，涂布LB培养基平板，待长出菌落后经蓝白斑筛选挑取白色单菌落，分别取PCR鉴定过的菌液提取重组质粒，用Ⅰ/I双酶切鉴定阳性菌液，酶切体系为：8 μL质粒DNA，2 μL 10×buffer，1 μLⅠ，1 μLI，8 μL ddH2O，总体系为20 μL。

1.5 pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表达载体构建

1.5.1 PLIN2目的基因片段的制备

将上述阳性克隆的菌液进行活化摇菌，扩大培养，然后提取pMD18-T-PLIN2质粒，酶切鉴定后回收目的条带，步骤同PLIN2基因克隆。

1.5.2 PLIN2基因片段与pIRES2-AcGFP1质粒的重组连接和鉴定

将PLIN2基因片段连接到pIRES2-AcGFP1质粒，连接产物使用DH5α感受态细胞进行转化，涂平板，蓝白斑筛选。分别取PCR验证过的菌液提取pIRES2-AcGFP1-PLIN2重组质粒，用双酶切鉴定阳性菌液，酶切体系同PLIN2基因克隆，最后送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.6 pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表达载体在3T3-L1前脂肪细胞中的表达

1.6.1 3T3-L1前脂肪细胞培养

培养条件：加入DMEM完全培养液，37 ℃、体积分数5 % CO2培养箱内进行培养。将长到90 %左右汇合的细胞中的旧培养基吸弃，然后加入胰酶消化。待细胞消化充分后，加入适量的完全培养液，离心（1 000 r/min，5 min）弃上清液，加入DMEM完全培养液后以5×104个/mL的密度接种，37 ℃、5 % CO2培养24 h进行传代；重复此步骤再传代。以2.2×105个/mL的细胞密度进行接种，使其在培养大约16 h后，细胞融合度达到80 %。

1.6.2 脂质体介导的细胞转染

根据本实验室前期研究优化的转染条件：采用pIRES2-AcGFP1- PLIN2质粒和Lipofectamine 2000脂质体试剂盒，并按其推荐的质粒：脂质体为0.8 μg/2.0 μL，以80 %细胞融合度进行转染，转染18 h，在转染结束后采用荧光显微摄影，观察转染情况。

2 结果

2.1 肌肉组织总RNA的提取

采集乌金猪背最长肌，提取总RNA，取2 μL在1.5 %琼脂糖凝胶进行电泳，检测mRNA的完整性（图1）。

图1 总RNA的提取

由图1可知，各泳道点样孔没有残留，28 S和18 S条带清晰，且28 S和18 S灰度比约2∶1，无拖尾现象出现，表明RNA无降解，质量可靠，可以进行后续试验。

2.2 PCR扩增及质粒酶切

通过RT-PCR技术，得到了乌金猪1 412 bp PLIN2基因的全编码区目的片段（图2）。PCR扩增产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测后，确认扩增产物的片段大小与目的片段大小相同。经过克隆后，将所提取的质粒进行酶切，酶切鉴定克隆的目的片段为PLIN2基因（图3）。

图2 PCR扩增PLIN2基因

注：M为DL 2000；1为扩增的PLIN2基因

图3 pMD18-T-PLIN2重组质粒的双酶切鉴定

注：M为DL 2000；1为提取的pMD18-T-PLIN2重组质粒；2为重组质粒的双酶切

2.3 pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表达载体构建

2.3.1 提取PLIN2基因目的片段

通过提取重组质粒pMD18-T-PLIN2，应用PCR方法，得到乌金猪1 412 bp PLIN2基因的全编码区目的片段。PCR扩增产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测后，确认扩增产物的片段大小与目的片段大小相同（图4）。

图4 PLIN2基因目的片段

注：M为DL 2000；1为PCR扩增PLIN2 基因片段

2.3.2 pIRES2-AcGFP1-PLIN2重组质粒的鉴定

PLIN2基因与表达载体pIRES2-AcGFP1连接转化后，提取的质粒经I和I双酶切得到1 412 bp片段（图5）。测序结果用DNAstart软件与NCBI进行比对，相似性为100 %。

图5 pIRES2-AcGFP1-PLIN2重组质粒酶切鉴定

注：M为DL 2000；1为pIRES2-AcGFP1-PLIN2重组质粒；2为pIRES2-AcGFP1-PLIN2的双酶切

2.4 转染后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达

重组质粒pIRES2-AcGFP1-PLIN2转染3T3- L1细胞，细胞融合度达80%，转染18 h后细胞生长情况、转染效果见图6。实验组细胞数量少于空白对照组，且在实验组中检测到绿色荧光，说明细胞转染成功。

图6 细胞生长及转染效果图（×10）

注：左边为普通光源下的细胞图片；右边为荧光下的图片。其中，a、c为细胞图，b、d为荧光图；a、b为对照组，c、d为实验组

3 讨论

脂滴是甘油三酯或胆固醇酯等中性脂质的主要储存场所，其表面分布有许多蛋白质分子[3-7]。脂肪分化相关蛋白（PLIN2）位于脂滴表面，能促进脂滴的形成，是一种重要的脂滴相关蛋白。研究发现，在小鼠成纤维母细胞中外源性过表达PLIN2基因，可以显著增加细胞内脂滴的大小和数量[8-9]。在3T3-L1前脂肪细胞早期分化阶段，PLIN2基因最先出现于脂滴表面，并随着细胞成熟分化逐渐增加[10]。同时研究发现，PLIN2基因的mRNA在培养的前脂肪细胞中显著表达[11-12]，但在脂肪细胞分化过程中表达量不断降低，因此在成熟脂肪细胞中未检测到PLIN2[13]。PLIN2基因对猪脂肪细胞内脂类代谢的调控机制还有待进一步探索，因此，构建PLIN2基因的真核表达载体，有助于进一步了解PLIN2基因的功能。

在体内研究前脂肪细胞的分化增殖过程非常困难，目前脂肪细胞增殖分化及调控主要应用体外细胞培养模型进行研究。而原代分离培养的猪脂肪细胞增殖速度慢，贴壁少，易自分化成脂滴，而且传代后细胞容易变形，因此，目前进行猪脂类代谢调控相关研究，广泛使用的是鼠3T3-L1前脂肪细胞[14-16]。

目前研究证实，在筛选克隆表达或分析启动子和增强子时，GFP是一个理想的报告基因。AcGFPI是野生型蛋白的荧光突变体，在氨基酸水平上与GFP的同源性高达94 %。它具有进行人类密码子优化的开放阅读框，这不仅提高了AcGFPI mRNA的转化效率，也提高了它在高等哺乳动物细胞中的表达水平[17-18]。本试验选用pIRES2-AcGFP1载体，首先是因为它是真核表达载体，其次还因为构建该载体的方法简便，转染后可以直接在荧光显微镜下观察有无绿色荧光，直观地了解转染效率。因此，构建的pIRES2- AcGFP1-PLIN2重组载体，能够更加高效地感染细胞，以便于从整体上了解PLIN2基因的功能。同时，PLIN2基因被整体地插入细胞中，能够稳定表达，不会在分化和传代的过程中丢失。

本试验成功克隆了PLIN2基因，同时成功构建了pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表达载体，并将其转入3T3-L1细胞中成功表达，为进一步研究PLIN2基因对脂肪细胞的调控机理奠定了基础。

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责任编辑：张爱婷

Construction of eukaryotic expression plasmid pIRES2-AcGFP1- PLIN2 and its expression in 3T3-L1 preadipocytes

ZHAO Xiao-qi, HUANG Ying, YANG Ming-hua, PAN Hong-bin, ZHAO Su-meiCorresponding Author

（Key Lab of Agricultural Animal Nutrition and Feed Science, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China）

The eukaryotic expression plasmid pIRES2-AcGFP1-PLIN2 was constructed and its transfection status in 3T3-L1 preadipocytes was observed. The PLIN2 gene was cloned into pMD18-T vector and digested byI/I. The digested product was digested and then ligated into pIRES2-AcGFP1 vector and transformed into DH5α competent cells, and pIRES2-AcGFP1-PLIN2 positive recombinant plasmid was extracted and transfected into 3T3-L1 preadipocytes. The Transfection condition was observed by microscope. The PLIN2 gene was successfully cloned. At the same time, the eukaryotic expression plasmid pIRES2-AcGFP1-PLIN2 was successfully constructed and expressed in 3T3-L1 preadipocytes. The green fluorescence was observed under the microscope, which laid the foundation for further studying the regulation mechanism of PLIN2 gene on adipocytes.

Wujin pig; PLIN2 gene; eukaryotic expression plasmid

S811.3

A

1008-5394（2018）02-0055-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.02.014

2018-03-26

国家自然科学基金项目（31760645，31260592，31060331）

赵小琪（1993－），男，硕士在读，主要从事动物分子营养与代谢调控方面的研究。E-mail：583478872@qq.com。

赵素梅（1974－），女，教授，博士，主要从事动物分子营养与代谢调控方面的研究。E-mail：zhaosm2009@126.com。